هماتوكريت يا حجم فشرده گلبولي

مقدمه
خون بافتي است كه از ۲ قسمت سلول ها و مايع تشكيل شده است. سلول ها عبارتند از گلبول هاي قرمز داريتروسيت ها، گلبول هاي سفيد (كلوسيت ها) و پلاكت ها مايع خون را پلاسما گويند كه حدوداً از ۹۰ درصد آب و ۱۰ درصد مواد جامد محلول در آن تشكيل شده است.
پلاسما شامل مواد پروتئيني، الكتروليت ها (مانند سديم، پتاسيم، كلسيم، بيكربنات و …) قند، كلسترول، اسيدهاي چرب، فسفوليپيدها، آنزيم ها و غيره مي باشند.
اعمال مختلف خون در بدن عبارتند از:

۱- حمل اكسيژن به بافت ها و خارج كردن دي اكسيد كربن از آنها
۲- حمل مواد غذايي به بافت ها
۳- انتقال فرآورده هاي متابوليسمي براي دفع به كليه ها، كبد، ريه، روده، پوست
۴- تنظيم آب داخل و خارج سلولي

۵- تنظيم حرارت بدن با انتشار خون در بافت ها
۶- توزيع هورمون ها و ساير مواد
۷- دفاع بدن و ايجاد ايمني
خون به عنوان يك بافت با اعمال فوق داراي ويژگي هايي است كه آن را از ساير بافتها متمايز كند. هنگامي كه خون كامل داراي ماده ضد انعقاد سانتريفوژ مي شود، فضايي كه به وسيله گلبول هاي قرمز فشرده شده اشغال مي شود، اصطلاحاً هماتوكريت نام دارد و به صورت درصد گلبول هاي قرمز خون نسبت به خون كامل بيان مي شود.
به عبارت ديگر هماتوكريت يك نمونه خون، نسبت حجم گلبول هاي قرمز به حجم كل خون است .
همچنين هماتوكريت به عنوان PCV يا حجم گلبول هاي قرمز فشرده شده شناخته شده است مقادير هماتوكريت كاملاً به موازات مقادير و تعداد گلبولهاي قرمز خون است. مقادير نرمال هماتوكريت همانند هموگلوبين و تعداد گلبول هاي قرمز خون تحت تأثير عوامل مختلفي مانند سن، جنس، نژاد و محيط و … قرار مي گيرد.

روش هاي خون گيري از ماهي:
۲ روش كلي خون گيري در ماهيان است:
۱) روش خون گيري مكرر از يك ماهي Serial Blood Sampliny
2) فقط يك بار خون گيري Once Only Sampling
روش خون گيري مكرر به دليل استرس ناشي از خون گيري كمتر استفاده مي شود لذا محققان روش فقط يك بار خون گيري را توصيه مي كنند.
زماني كه زنده بودن ماهي پس از خون گيري مهم نباشد مي توان ماهي را كشت به ۳ طريق:
۱- يك ضربه محكم و سريع را با استفاده از يك شي فلزي دسته اسكالپر، به ناحيه اتصال جمجمه و ستون مهره ها در ناحيه سر وارد كنيم. در اين حالت نخاع قطع شده و منجر به مرگ مي شود.
۲- نخاع را قطع كنيم و با فرو كردن و حركت جانبي تيغه اسكالپر در محل اتصال جمجمه به اولين مهره ستون فقرات در ناحيه سر با يك حركت افقي
۳- استفاده از مواد بيهوش كننده با غلظت بيش از غلظت لازم براي بيهوشي
در صورتي كه بخواهيم ماهي زنده بماند پودر Ms 222 را به نسبت خاص براي ماهي مورد نظر حل كرده ماهي ها را يكي يكي درون محلول گذاشته و پس از ۲ دقيقه بيهوش مي شوند ماهي را خشك كرده از پهلو روي ميز گذاشته از بالاي ساقه دمي باز اوليه ۴۵ درجه در كنار خط جانبي وارد عضله شده وقتي سرنگ به ستون مهره جاندار رسيد با بازي در آن به رگ هاي اين قسمت رسيده و با كشيدن پيستون سرنگ مقدار خون مورد نياز به دست مي آيد.
يا از انتهاي باله مخرجي در قسمت ساقه دمي و از قسمت شكمي ماهي به صورت عمودي سوزن را وارد عضله ماهي كرده و وقتي بر ستون مهره رسيد (به شبكه رگ هاي اين قسمت) با كشيدن پيستون سرنگ ؟؟؟ تأمين مي شود (جمالزاده، ۱۳۸۰)
از نواحي مختلف مي توان خون گيري كرد:
– قطع ساقه دهي در ماهي كوچك
– در ماهيان بزرگ تر خون را مي توان با استفاده از آئورت پشتي يا Dosal aortic puncture آئورت شكمي –قلب به دست مي آيد.
زماني كه ماهي ما ارزش داشته باشد و زنده ماندن آن مهم باشد و ولش لوله گذاري Canultion مطرح است كه مانند قرار دادن يك ۳ راهي لوله اي نازك در وسط جريان خون است. كه براي ماهيان بزرگ تر استفاده شود. سر لوله گره زده مي شود و هر وقت نياز باشد خون از اين منطقه برداشته مي شود. (محل قرارگيري ۳ راهي لوله اي نازك كمان آبششي رگ هاي آوران – وابران است)

بهترين نتايج از تلفيق روش هاي كشتن ماهي Stunning به همراه استفاده از ماده ضد انعقاد مپارين و نگه داري نمونه خون گرفته شده در سرما و سرعت عمل در انجام مراحل حاصل مي شود.
مواد و روش كار:
 ماهي از خانواده Cyprinidae (كپور-ماهي حوض)
 قيچي
 خط كش خواندن هماتوكريت
 سانترينوژ هماتوكريت
 خمير هماتوكريت (موم) Cristoseal
 لوله هماتوكريت
هماتوكريت را ممكن است مستقيماً به وسيله سانتريفوژ و به روش هاي ماكرو يا Wintrobe و نيتروب و ميكروهماتوكريت اندازه گيري كنند يا به صورت غير مستقيم توسط دستگاه هاي اتوماتيك و از حاصل ضرب MCV در شمارش گلبول هاي قرمز به دست آورند.
روش و نيتروب در گذشته استفاده زيادي داشت ولي امروزه به علت زياد بودن خون مورد نياز، مدت زمان طولاني سانتريفوژ و زياد بودن پلاسماي به دام افتاده در لابه لاي گلبول هاي قرمز كاربرد كمي دارد.
روش ميكروهماتوكريت Microhatocrit
در اين روش از لوله هاي ميكروهماتوكريت با طول تقريباً ۷ سانتي متر و قلمرو يك ميلي متر استفاده شود در انتهاي لوله هاي ميكروهماتوكريت يك حلقه رنگي وجود دارد. در لوله هاي ميكروهماتوكريت فاقد ضد انعقاد، حلقه آبي و رنگ و در لوله هاي ميكروهماتوكريت آغشته به ماده ضد انعقاد هپارين، حلقه قرمز رنگ يافت مي شود. لوله هاي اخير را با هپارين كه به نسبت يك به ۱۰۰۰ رقيق شده است پر كرده و سپس در حرارت ۵۶ تا ۳۷ درجه سانتي گراد خشك مي كنند اگر از خون داراي

ماده ضد انعقاد استفاده مي شد بايد لوله هاي آبي رنگ استفاده شود ولي چنانچه از خون مويرگي استفاده مي شود از لوله هاي ميكروهماتوكريت با حلقه قرمز رنگ استفاده شود.
سانتريفوژ ميكروهماتوكريت داراي حوزه سانتريفوژي ۱۰۰۰۰ تا ۱۵۰۰۰ است كه پس از روشن شدن در عرض ۳ ثانيه به حداكثر سرعت مي رسد.
در روش ميكرو، لوله هاي مو ئينه مدرج نيستند در اين روش بايد ارتفاع ستون خون را كه شامل

پلاسما گلبول هاي قرمز است با خط كش ميلي متري مخصوص يا صفحه مدرج مخصوص ميكروهماتوكريت، قرائت كرد.
اينجا *
۱- ماهي را قطع ساقه دمي كرده لوله هپارينه را در تماس با خون قرار مي دهيم لوله ميكروهماتوكريت را به طوري كه حباب مواد ايجاد نشود پر مي كنيم.
۲- انتهاي خشك لوله ميكروهماتوكريت را در وضعيت عمودي در خمير هماتوكريت فرو كرده تا در حدود ۶-۴ ميلي متر از انتهاي لوله از خمير پر شود. در حين عمل نبايد به خون موجود در لوله فشار وارد شود.
۳- دو لوله هماتوكريت را در شيارهاي شعاعي سانتريفوژ، به طوري كه در وضعيت مخالف و روبروي يكديگر باشند قرار داده انتهاي بسته لوله ها بايد به طرف خارج صفحه سانتريفوژ قرار داشته باشد.
۴- به مدت ۵ دقيقه دستگاه را به كار بياندازيد با استاندارد ۷۰۰۰ rpm
5- به محض اينكه سانتريفوژ متوقف شد لوله هاي ميكروهماتوكريت را از آن خارج كرده و با استفاده از خط كش يا جدول مدرج مخصوص، هماتوكريت را برحسب درصد قرائت مي نمائيم اختلاف ۲ لوله هماتوكريت بايد در حدود درصد باشد در غير اين صورت بايد آزمايش تكرار شود. (عامري ۱۳۷۸)
نتايج:
هنگامي كه خون كاملاً سانتريفوژ مي شود گلبول هاي قرمز به علت وزن مخصوص زيادتري كه نسبت به ساير عناصر خوني دارند در ته لوله قرار مي گيرند به طوري كه به ترتيب از سر لوله به پايين طبقاتي به شرح زير ايجاد مي شود:
۱- پلاسما: طبقه زرد رنگ
الف- ترمبوسيت ها: طبقه رويي به رنگ كرم
ب- مكوسيت ها: طبقه خاكستري قرمز رنگ
ج- گلبول هاي قرمز هسته دار كه در لايه بافي كوت در صورت وجود ايجاد رنگ قرمز مي كنند.
۳- طبقه گلبول هاي قرمز
(عامري ۱۳۷۸)
براي خواندن ميزان هماتوكريت ها با خط كش هماتوكريت: لوله هماتوكريت را در شيار خط كش هماتوكريت قرار داده و انتهاي پايين ستون گلبول هاي قرمز را با خط صفر تنظيم كرده سپس خط سفيد متحرك مياني را با سطح بالاي گلبولهاي قرمز تنظيم و درصد حجم گلبولهاي قرمز را از روي ستون مندرج مي خوانيم. ميزان Hc+ در ماهيان بالغ بيشتر از نابالغ است. (جمالزاده ۱۳۸۰)
اين در آزمايش هماتوكريت به ترتيب زير است:

(۱۹۷۹) Smeda , Hooston . (1979) Millich 8 Catlett
در مطالعات حجم خون پلاسما را ۸/۲ و ۳ درصد محاسبه نموده اند. حجم خون ماهيان نسبت به ساير مهره داران كمتر است. در ماهيان اسلاموبرانش اين ميزان بين ۶-۸ ميلي بيتر به ازاء ۱۰۰ گرم و در استخواني بين ۲-۴ ميلي ليتر به ازاء ۱۰۰ گرم است.
ميزان هماتوكريت را با درصد نشان مي دهند. معمولاً در ماهيان اسلاموبرانش (آبشش صفحه اي ها) ميزان هماتوكريت كمتر از ۲۵ درصد است.
در ماهيان استخواني اين ميزان بين ۱۰ تا ۳۰ درصد متغير است.
در كپور معمولي حدود ۲۷ درصد است.
درماهيان دريايي فعال مثل تن ماهيان يا Thunnus بالاترين ميزان هماتوكريت كه حدوداً بيش از ۵۰ درصد است مشاهده شده است. (هماتوكريت انساني ۴۵ درصد).
ميزان هماتوكريت و به تبع آن هموگلوبين با توجه به عواملي چون گونه، فصل، دما، وضعيت تغذيه و بهداشت ماهي متفاوت است در برخي گونه هاي وجود تغييرات شبانه روزي هم گزارش شده است.

يكي از عوامل تغيير هماتوكريت ماهيان تنظيم فشار اسمزي است. در صورت عدم تنظيم فشار اسمزي در ماهيان آب شيرين به دليل ورود بيش از حد آب به بدن خون اين ماهيان رقيق شده و هموديليشن از آب شيرين به شور بالا مي رود. و Hct كاهش مي يابد.
در ماهيان آب شور به دليل خروج آب از بدن خون غليظ شده و Hemoconcentration و Hct و هماتوكريت، آن بيشتر مي شود به نظر مي رسد Hct ماهيان دريايي از اين نظر بيش از ماهيان آب شيرين است.
بحث:

۱- سرعت و مدت كافي براي سانتريفوژ كردن شروط اساسي در به دست آوردن يك هماتوكريت صحيح است گلبول هاي قرمز توسط سانتريفوژ كردن بايد آنقدر فشرده شوند كه با سانتريفوژ كردن بيشتر حجم گلبول هاي قرمز متراكم، كاهش پيدا نكند.
۲- اگر انتهاي لوله هاي ميكروهماتوكريت به طور ناقص بسته شود باعث كاهش كاذب نتايج خواهد شد.
۳- عدم سانتريفوژ كافي و همچنين ماندن لوله ها به مدت بيشتر از ۱۰ دقيقه پس از اينكه سانتريفوژ متوقف شد باعث افزايش كاذب نتايج خواهد شد.
۴- اگر مقدار ماده ضد انعقاد بيش از حد نياز باشد به علت چروكيده شدن گلبول هاي قرمز خون باعث كاهي كاذب خواهد شد.
۵- در حين عمل سانتريفوژ كردن، بخش كوچكي از گلبول هاي سفيد، پلاكت ها و پلاسما در ميان گلبول هاي قرمز به دام مي افتند كه خطاي ناشي از آن اهميت چنداني ندارد. افزايش هماتوكريت حامل از پلاسماي به دام افتاده (Trapped Plasma) گاهي بيشتر از هماتوكريت حاصل از گلبول هاي سفيد و پلاكتهاي به دام افتاده است كاهش نيروي سانتريفوژ باعث افزايش مقدار پلاسماي به دام افتاده در ميان گلبولهاي قرمز مي شود و همچنين مقدار آن در روش هاكر و بيش از ميكرو است. در روش ميكرو هماتوكريت، پلاسماي به دام افتاده حدود يك تا ۳ درصد كل ستون گلبول هاي قرمز متراكم مي باشد.
۶- به علت كمتر بودن زمان سانتريفوژ و نيز خطاي ناشي از پلاسماي به دام افتاده روش ميكرو هماتوكريت بر روش ماكرو ارجحيت دارد و به عنوان روش مرجع توسط كيته بين المللي استاندارد كردن هماتولوژي (ICSH) توصيه شده است. ميزان خطاي اين روش ۲-۱ درصد است.
۷- براي به دست آوردن نتايج صحيح نمونه ها بايد در سرما نگهداري شوند.
۸- در هنگام قرائت Hc+ بايد بالاترين حد لايه گلبول هاي قرمز خوانده شود اين مطلب زماني كه تعداد گلبول هاي سفيد يا پلاكت ها افزايش شديد دارد داراي اهميت فراوان است. (عامري ۱۳۷۸)
۹- مقدار هماتوكريت به اندازه تعداد گلبولهاي سرخ و همچنين حجم پلاسما بستگي دارد اگر مقدار آن بيش از اندازه طبيعي باشد مي تواند نمودار افزايش گويچه ها يا كاهش حجم پلاسما باشد.
– اگر مقدار هماتوكريت كمتر از حد طبيعي باشد ممكن است به دليل كاهش تعداد گويچه هاي قرمز يا افزايش حجم پلاسما باشد (كم خوني- انساني)

۱۰- از آنجايي كه هموگلوبين معمولاً حجم گلبول قرمز را اشغال مي كند ميتوان با تقسيم كردن PCV بر عدد ۳ مقدار تقريبي Hd را برحسب گرم در دسي ليتر به دست آمد. و با توجه به اينكه PCV بستگي كامل به اندازه و مقدار گلبولهاي قرمز موجود در واحد خون دارد مي توان از تقسيم كردن PCV به عدد ۶ مقدار تقريبي گلبول هاي قرمز را در يك ميلي مترمكعب خون بر حسب ميليون به دست آورد. (عامري ۱۳۷۸)
تهية گسترش خون (Blood Smear Preparation)
بررسي گسترش خوني بخش مهمي از ارزيابي هماتولوژي را تشكيل مي دهد. قابل اعتماد بودن اطلاعات به دست آمده از بررسي گسترش خوني، بستگي زياد به تهيه و رنگ آميزي خوب گسترش ها دارد.
در اينجا سه روش براي تهية گسترش هاي خون شرح داده مي شود كه عبارتند از: روش گسترش روي لام ‌( Slide Film) يا روش دو لامي يا روش گوه اي (The two slide or wedge method) روش گسترش روي لامل (Cover glass method) و روش خودكار يا چرخشي (Spinner method).
دو روش اضافه بر روش هاي فوق براي تهيه‌گسترش هاي خون در برخي موارد مورد استفاده قرار مي گيرند. يكي از اين موارد تهية گسترش از لاية بافي كوت (Buffy coat) در لوله هاي ميكروهماتوكريت است و هنگامي مورد استفاده قرار مي گيرد كه تعداد گلبول هاي سفيد خون به شدت كاهش يافته است و اين روش باعث تغليظ سلول هاي هسته دار خون مي گردد. روش ديگر تهية گسترش ضخيم خون (Thick blood smear) است كه معمولاً براي جستجوي انگل هاي خوني انجام مي شود.
پس از تهية‌گسترش خون، رنگ آميزي هاي عمومي يا اختصاصي انجام شده و بررسي مرفولوژي سلول هاي خوني و شمارش افتراقي گلبول هاي سفيد بر روي آن صو

رت مي گيرد.
۱- روش تهية‌ گسترش بر روي لام يا روش دو لامي يا گوه اي
۱- دو عدد لام شيشه اي تميز انتخاب كنيد (لام هايي كه براي تهية گسترش خون به كار مي روند بايد كاملاً سالم و عاري از هر گونه آلودگي و غبار باشند (چنانچه اين لام ها قبلاً مورد استفاده قرار گرفته اند بايد ابتدا در الكل ۹۵ درصد قرار داده و با پارچة تميز كاملاً خشك شوند).
۲- از يكي از دو لام به عنوان لام پخش كننده استفاده كنيد.
۳- حتي المقدور گسترش خون را بايد از خون تازه اي كه به آن مادة ضد انعقاد افزوده نشده است تهيه كرد. چنانچه از خون داراي مادة ضد انعقاد استفاده مي كنيد بايد در اسرع وقت نسبت به تهية گسترش اقدام كنيد.
۴- به وسيلة لولة ميكروهماتوكريت يك قطرة كوچك از خون مخلوط شده را در يك

سانتي متري لبة لام قرار دهيد.
۵- لام را بر روي يك سطح صاف قرار دهيد، در حالي كه قطرة خون در طرف راست شما قرار دارد (براي افراد چپ دست بهتر است در سمت چپ قرار گيرد).
۶- توسط انگشت نشانه و شست دست چپ دو طرف لام را نگه داريد و لام پخش كننده را طوري در دست راست بگيريد كه لام بين انگشت شست و چهار انگشت ديگر قرار گيرد (تصوير شمارة ۱۵).
۷- انتهاي لام پخش كننده را كمي جلوتر از قطرة خون قرار دهيد، به طوري كه بين دو لام زاوية تقريباً ۳۰ تا ۴۵ درجه ايجاد شود.
۸- لام پخش كننده را كمي به عقب بكشيد تا با قطرة خون تماس پيدا كند و خون در لبة لام به طور يكنواخت پخش گردد. چنانچه خون در سرتاسر لبة لام پخش نشد مقداري لام پخش كننده را حركت دهيد تا اين خون در سرتاسر لبة لام پخش شود. دقت كنيد كه خون به قسمت جلوي لام پخش كننده سرايت نكند.
۹- لام پخش كننده را با يك حركت يكنواخت و ملايم در سطح لام ديگر حركت دهيد تا يك لاية نازك از خون به دست آيد.
۱۰- با تكان دادن گسترش در جريان هوا گسترش را به سرعت خشك كنيد. گسترش را نبايد به حرارت يا دميدن به آن خشك كرد.
۱۱- گسترش را مي توان با نوشتن مشخصات بيمار نشانه گذاري كرد. نوشتن مشخصات توسط قلم الماس روي انتهاي لام يا توسط مداد بر روي انتهاي ضخيم گسترش خوني انجام مي شود.
۲- روش تهية گسترش بر روي لامل
۱- براي اين روش، لامل هاي نمرة ۱ يا ۵/۱ (مربع به اضلاع ۲۲ ميليمتر) توصيه مي شود. لامل ها بايد كاملاً تميز باشند.
۲- يكي از لامل ها را توسط دو گوشة آن بين انگشت شست و انگشت نشانه قرار دهيد.
۳- يك قطرة كوچك خون به قطر ۲ تا ۳ ميليمتر در مركز لامل قرار دهيد.
۴- با دست ديگر يك لامل را مثل لامل اول نگه داريد.
۵- به آرامي لامل دوم را روي لامل اول كه حاوي يك قطرة خون است به صورت ضربدري قرار دهيد، به طوري كه قطرة خون بين دو لامل دوم روي لامل اول قرار گيرد خون بين آن دو پخش مي شود.
۶- قبل از آنكه خون كاملاً بين دو لامل پخش شود، دو لامل را با يك حركت سريع، ناگهاني، افقي و در دو جهت مخالف بكشيد. دقت كنيد كه لامل دوم را نبايد از روي لامل اول بلند كرد زيرا حفراتي در گسترش باقي خواهد ماند. همچنين بايد از فشار دادن دو لامل بر روي يكديگر خودداري شود.
۷- هر دو لامل را به صورتي كه سطح گسترش رو به بالا قرار گيرد، روي كاغذ تميزي قرار دهيد تا در مجاورت هوا خشك شوند.
بحث:

۱- در گسترش روي لامل توزيع سلول ها اتفاقي تر از گسترش روي لام است ولي به علت كوچك و شكننده بودن لامل، فن و رنگ آميزي گسترش بر روي لامل براي افراد مبتدي مشكل است.
۲- به محض اينكه قطرة خون روي لامل اول قرار مي گيرد بايد بدون تأخير لامل دوم روي آن قرار گيرد. اگر قطرة خون بيشتر از ۵-۳ ثانيه بماند، توده شدن پلاكت ها و گلبول هاي سفيد و قرمز و پديدة رولو در گلبول هاي قرمز ايجاد مي شود.

۳- قرار دادن قطرة بزرگ خون باعث ضخيم شدن گسترش تهيه شده مي گردد.
۴- يك روش اصلاح شده تهية گسترش بر روي لامل به اين ترتيب است كه به جاي يكي از لامل ها از يك لامل شيشه اي استفاده مي شود. در اين روش يك قطرة خون در مركز لام شيشه اي قرار دهيد و در حالي كه لامل بين دو انگشت شست و نشانه قرار دارد آن را روي قطرة خون بر روي لام شيشه اي قرار دهيد و قبل از اينكه پخش شدن خوب كامل شود، لامل را از لام به وسيلة يك حركت سريع جدا كنيد در نتيجه گسترشي كه بر روي لام ايجاد مي گردد همانند گسترشي است كه بر روي لامل ايجاد مي شود.

۳- روش تهية گسترش اتوماتيك يا چرخشي
تهية گسترش هاي خون به اين روش، محاسن انجام سادة تهيه گسترش به روش روي لام و توزيع يكنواخت سلول ها به روش لامل را با هم دارد و به وسيلة انواع خاصي از سانتريوفوژ به نام اسپينر (Spinner) انجام مي شود. در اين دستگاه يك لام شيشه اي تميز روي يك صفحة پلاتين قرار گرفته و در حدود ۲/۰ ميلي ليتر خون حاوي EDTA در مركز لام گذاشته مي شود. سپس دستگاه روشن و موتور به كار مي افتد و در يك زمان مشخص يك گسترش يك لايه اي بر روي كل سطح لام ايجاد مي شود. دستگاه هاي پيشرفته تر اسپينر مجهز به سيستم نوري هستند. در اين نوع دستگاه ها دسته اي از نور از لام به يك دستگاه حساس برخورد مي كند و در زماني كه سطح لام به ميزان كافي از خون پر شد، دستگاه حساس آن را تشخيص داده و صفحة پلاتيني به طور خودكار از حركت باز مي ايستد. در اين روش خون بر اساس هماتوكريت بيمار بر روي لام پخش مي شود. در اين روش گسترش به گونه اي ايجاد مي شود كه سلول ها از هم جدا بوده و هيچ كدام روي هم قرار نمي گيرند و گلبول هاي سفيد را مي توان به راحتي در هر نقطه از گسترش تشخيص داد.
گسترش ها بايد در هوا خشك شوند (عامري ۱۳۷۸)

مرحله بعد تثبيت است كه به ۳ روش انجام مي شود:
۱) استفاده زا عبور گسترش ها ۳-۴ مرتبه روي شعله و توجه نمي شود.
۲) استفاده از الكل ۵ دقيق
۳) استفاده از محلول ۵۰ درصد الكل فرمالين ۱ دقيقه
رنگ آميزي به ۳ روش
روش عمودي ۱- Romanowsky method
جهت رنگ كردن چربي ها ۲- Sudan Black B
جهت رنگ كربوهيدرات ها ۳- Periodic Acid Schiff (PAS)
روش ۲ و۳ اختصاص ماهي ها هستند.
روش Romanowsky:
1- تهيه و خشك كردن گسترش ها در هوا
۲- تثبيت در متانل ۵ دقيقه
۳- قرار دادن در رنگ Commercial leishman stain مدت ۲ دقيقه
۴- شستشوي كامل در آب
۵- رنگ آميزي با محلول Commercial Bfferd Gimsa 2 دقيقه
۶- شستشو در بافي فسفات از مولار با PH 4/6 و سپس آب مقطر
۷- خشك كردن در هوا

در اين روش سيتوپلاسم قرمز و هسته به رنگ آبي تيره و بنفش ديده مي شود.
۲- روش سودان بلك B:
1- تهيه و خشك كردن گسترش ها در هوا
۲- تثبيت در فيكاتيو ۱۰ ميلي ليتر فرمالين و ۹۰ ميلي ليتر اتانل به مدت ۵ ثانيه
۳- شستشو در آب جاري به مدت ۱۰ دقيقه
۴- خشك كردن در هوا
۵- رنگ آبزي با سودان بلك B به مدت ۳۰-۶۰ دقيقه دماي اتاق
۶- شستشو در اتانل ۷۰ درصد
۷-رنگ آميزي به صورت lightly ملايم و سريع با Commercial Bufferd Gimsa مشابه روش رومانوسكي
در نتيجه اين روش چربي ها در سلول ها به رنگ سياه و ساير ساختمان به رنگ خاكستري روشن مي شود.
۳- روش PAS:
1- تهيه و خشك كردن گسترش ها در هوا
۲- تثبيت در فيكاتيو فرمالين – اتانل به مدت ۱۰ دقيقه
۳- شستشو در آب جاري به مدت ۱۰ دقيقه
۴- رنگ آميزي با Commercial Periodic به مدت ۲۰ دقيقه
۵- شستشو با آب شير
۶- غوطه ور كردن گسترش ها در Commercial Schiff reagent 20 دقيقه
۷- شستشو و رنگ آميزي با Commercial hemato yliue lightly
8- شستشو و خشك كردن در هوا

در نتيجه اين رنگ آميزي در صورت مثبت بودن PAS رنگ قرمز تيره يا Rich magenta قرمز فلفلي يا بنفش ظاهر مي شود كه البته درجه بروز رنگ متفاوت است.
بحث در روش گسترش با ۲ لامل

۱- به محض قرار گيري قطره خون بر روي لام و بدون هيچ تأخيري بايد گسترش تهيه شود هر گونه تأخير باعث توزيع غير طبيعي گلبول هاي سفيد شود به طوري كه در انتهاي نازك گسترش ها تجمع حاصل مي كنند. و ممكن است گلبول هاي قرمز توليد حالت رولو كنند و پلاكت ها تجمع يابند.
۲- ضخامت بستگي به اندازه قطره خون، زاويه بين ۲ لام و سرعت حركت لام پخش كننده بر روي لام ديگر دارد. در يك سرعت معين افزايش زاويه لام پخش كنند باعث افزايش ضخامت گسترش خواهد شد.

۳- گسترش نبايد تمام سطح را بپوشاند در گسترش خوب يك قسمت ضخيم يك قسمت نازك يك قسمت تغيير تدريجي از ضخيم به نازك وجود دارد.
۴- گسترش ما بايد ظاهري صاف و هموار داشته و هيچ گونه برآمدگي و موج فرو رفتگي نداشته باشند.
۵- در هنگام نشانه گذاري از خودكار نبايد استفاده كرد.
۶- به محض تهيه گسترش در جريان هوا خشك شود دير خشك شدن سبب تجمع سلول ها و دندانه دار شدن اريتروسيت ها مي شود.

بحث در روش ۲ لامل:
۱- در گسترش روي لامل توزيع سلول ها اتفاقي تر از گسترش روي لام است ولي به علت كوچك و شكننده بودن لامل، فن و رنگ آميزي گسترش بر روي لامل براي افراد مبتدي مشكل است.
۲- به محض قرار دادن قطره خوني روي لامل بايد لامل دوم قرار گيرد زيرا بيشتر ماندن قطره خون سبب توده شدن پلاكت ها و گلبول هاي سفيد و قرمز مي شود.