وقوع بیماری باکتریائی لکه برگی و بلایت چغندر ناشی از
aptata . Pseudomonas syringae pv در ایران

چکیده
در بهار و تابستان ۸۱- ۱۳۸۰ نشانه هائی از یک بیماری جدید روی چغندر (Beta vulgaris) در حومه بابل مشاهده گردید.علائم بیماری روی برگ ها به صورت لکه های نکروزه قهوه ای تیره، و اغلب با هاله زرد رنگ در حاشیه بود.در آلودگی های شدیداکثر برگهای بوته خشک شده بودند . از کشت بافتهای آلوده روی محیط آگار غذائی حاوی گلوکز یک سودوموناس لوان مثبت با کلنی سفید تا بژ جدا گردید.جدایه ها در آزمون های کاتالاز، هیدرولیز کازئین،ژلاتین و نشانه و تولید بتا گلوکوزید از

مثبت بودند. تمامی جدایه ها از اریتریتول ، فروکتوز ،گلوکز ،گلیسرول ، اینوزیتول ، اینولین ،مانیتول ، مانوز ، سوربیتول ، سوکروز ،زایلو ، لاکتات و D- تارتارات استفاده کرده ، ولی نتوانستند از دولسیتول ، مالتوز ، پالاتینوز، رامنوز یا L – تارتارات به عنوان منبع کربن استفاده کنند. بیماریزائی سه جدایه با تزریق و محلول پاشی سوسپانسیون سلول ها روی بوته های ۶-۵ برگی چغندر در گلخانه به اثبات رسید. جدایه ها aptata . Pseudomonas syringae pv شناسائی شدند. نقوش الکتروفورزی پروتئین های سلولی جدایه ها شباهت زیادی به نقوش استرین پاتوتیپ aptata . P. syringae pv

مقدمه
بیماری های لکه برگی و بلایت باکتریائی در چغندر (Beta vulgaris) به وسیله چند گونه و پاتوار از باکتری های گیاهی از جمله :
(keyworth et al.) Collins & Jones 1983 Curtobacterium flaccumfaciens pv.betae

pseudomonas syringae pv. Syringae Van Hall 1902
Aptata (Brown & Jamieson)yong et al.1978
Aptata (Brown & Jamieson ) yong et al.1978. P. syringae pv
و یک پارتوارXanthomonas که X.campestris pv.betae Robbs etal.1981 نامگذاری شده ، ایجاد می شود(Bradbury 1986 , Whitney & Duffus 1986) . درایران لکه برگی ناشی از Xanthomonas sp. در مزارع چغندر قند در اصفهان وجود دارد، علائم این بیماری که به صورت لکه های رنگ پریده و سپس خشک (نکروزه) و وسیع در پهنک برگ است متمایز از علائم بیماری بلایت باکتریائی ناشی از X.c.pv.Betae گزارش شده از برزیل ، است (samavatian & rahimian 2001) در سالهای ۱۳۸۰-۱۳۸۱ یک بیماری با علائم لکه برگی و سوختگی کامل برگ در برخی از مناطق شهرستان بابل مشاهده گردید . شدت بیماری در بعضی از مزارع به حدی بود که باعث مرگ گیاهچه ها و بوته های چند برگی و سوختگی اکثر برگهای پائینی بوته های مسن تر شده بود. لکه ها اغلب به صورت پراکنده در پهنک برگ و گاهی در حاشیه برگ ها قابل مشاهده بود و آبسوختگی و کلروز مشخصی در اطراف لکه های نکروزه وجو داشت . لکه ها اغلب یک تا چند سانتی متر قطر داشته و به رنگ قهوه ای مایل به سیاه بودند. با گسترش لکه ها به سمت رگبرگ میانی ، بخش وسیعی از پهنک تا تمامی آن سوخته و سوختگی به سمت دمبرگ پیشروی می کرد و نکروز دمبرگ به صورت نوارهای طولی قابل مشاهده بود. علائم بیماری در طول فصل رشد و به خصوص در شرایط هوای خنک و بارانی روی بوته های جوان شدید بود. علائم این بیماری با ع

لائم لکه برگی و بلایت گزارش شده از اصفهان (samavatian & rahimian 2001 ) متفاوت بود. در مشاهده میکروسکپی تراوش جمعیت سلولهای باکتریائی (ooze) از حاشیه لکه های بریده شد.بررسی اخیر در زمینه شناسائی عامل بیماری لکه برگی چغندر در مازندران صورت گرفته است. چکیده نتایج این بررسی قبلاً ارائه شده است (Babaeizad et al.2004) .

روش بررسی

کشت و جداسازی
برگ های چغندر دارای علائم بیماری جمع آوری شد و پس از شستشو با آب، بخش هائی که در برگیرنده یک لکه بود جدا گردید . این قطعات در چند قطره آب مقطر در داخل تشک های استر

یل به کمک تیغ خرد گردید ند. نیم ساعت پس از نگهداری نمونه ها در دمای آن قطره ای از سوسپانسیون حاصل روی محیط آگار غذائی حاوی %۵/۰ گلوکز (۲۳ گرم nutrient agar 5 گرم گلوکز در یک لیتر آب ) (NAG) مخطط گردید . تشک های کشت شده در دمای C°۲۵ نگهداری شدند. دو روز پس از کشت ، کلنی های باکتری به رنگ سفید تا بژ برجسته ، به قطر ۳-۲ میلی متر در سطح ظاهر گردیدند. تک کلنی ها انتخاب و روی محیطNAG تکثیر گردید. جدایه ها روی محیط فوق در یخچال و یا به صورت سوسپانسیون کدر در آب مقطر استریل در دمای اتاق نگهداری شدند. تعدادی از جدایه ها برای نگهداری بلند مدت لیوفی لایز (Lyophilized) (Schaad et al.2001)گردیدند .
آزمون بیوشیمیائی و فیزیولوژیک
آزمون های بیوشیمیایی و فیزیولوژیک طبق روش های متعارف
(schaad et al.2001 ,Lelliott et al.1996,KING et al.1954,Fahy & Persley 1983)
انجام شد بررسی طیف منابع کربن قابل استفاده جدایه ها بر اساس روش های متداول (schaad et al.2001) و با استفاده از محیط معدنی پایه آیر و همکاران (Ayer et al.1919) انجام گرفت . قندها و اسید های آمینه باروش تندال (Tyndall)استریل و غلظت نهائی ۱-۲/۰درصد به محیط پایه

حاوی ۲/۱ درصد آگارز اضافه شد. نمک سدیم اسیدهای آلی جداگانه اتو کلاو شده و به غلظت نهائی ۲/۰ درصد به محیط آیر اضافه شد (schaad et al.2001) پس از گذشت باکتری ها در سطح محیط های کربوهیدراتی و نگهداری تشک ها در دمایC °۲۸ – ۲۵ ، نتایج استفاده یا عدم استفاده از منابع کربنی براساس مقاسیه میزان رشد و تغییر اسیدیته محیط نسبت به شاهد (محیط آیر فاقد منبع کربنی ) تا سه هفته پس از کشت ارزیابی گردید
(Rahimian 1995 , Lelliott & stead 1987,Fahy & Persley 1983).
انگشت نگاری ژنومی

جداسازی DNA
دو جدایه به عنوان نماینده در انگشت نگاری های ژنومی به کار برده شدند.جدایه ها در محیط آگار غذائی به صورت چمنی کشت شد. پس از دو روز رشد در دمای C °۲۸ – ۲۵ ، سلول ه در آب مقطر به صورت سوسپانسیون در آمدند. پس از سانتریفیوژ کردن سوسپانسیون در g×۶۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه ، رسوب سلول ها در آب مقطر پخش شده و کدری سوسپانسیون در ۱ واحد (optical density)OD در ۶۰۰ نانومتر تنظیم گردید. OD قسمتی از سوسپانسیون ها در ۲/۰ – ۱/۰ واحد تنظیم و به آنها ۱/۰ حجم KOH یک نرمال اضافه شد.نمونه ها سپس به مدت یک دقیقه جوشانده شدند. از این نمونه ها ،بدون تیمار بعدی و یا پس از سانتریفیوژ به مدت ۲ دقیقه در g×۹۰۰۰ و حذف رسوب ، به عنوان DNA الگو (Template) در واکنش های زنجیره ای پلیمراز (PCR) استفاده شد. بخش دیگر سوسپانسیون های تهیه شده برای استخراج DNA به کار برده شد. بافرتریس – EDTA(TE،یک دهم مولار HCI ،Tris،۸pH، ۱۰ میلی مولار EDTA ) به حجم مساوی به نمونه ها افزوده شدهSDS به غلظت نهائی ۲ درصد ، سلول پاره شدند.DNA به روش های متداول با افزودن فنل و کلروفرم استخراج و با اتانول رسوب داده شد(Ausubel et al.1991).رسوب اسیدهای نوکلئیک در بافر TH × ۱/۰ حل وپس از تعیین غلظت به کمک اسپکتروفتو متر به بخش هائی تقسیم و در C °۲۰- نگهداری شد. از جدایه های استاندارد P.s.tomato,P.s. aptata(ICMP 459) ( جدا شده از گوجه فرنگی ) ،P.s.syringae (جدا شده از هلو و نیشکر مازندران )،P.s maculicola (ICMP 3935) و P.viridiflava(جدا شده از پرتقال مبتلا به بلاست درمازندران ) نیز DNA استخراج و در انگشت نگاری به کار برده شد.
rep- PCR
rep- PCR (Repetitive exteragenic palindroamic) طبق روش های توصیه شده (( Weingart & Volksch 1997 ,Versal.ovic et al.1991.1994 و با استفاده از پرایمرهای BOXAIR ، ERICIR و ERIC2 انجاک شد. واکنش ها در حجم ۵۰ میکرولیتر و شامل (غلظت نهائی)۶۷ میلی مولار تریس هیدروکلرا ید ۸/۸ pH ، ۵/۳ میلی مول کلرید منیزیم ، ۱۰ میلی مول مرکاپتواتانول ، ۱۶ میلی مول سولفات آمونیوم ،۴۰۰ میکرومول از هر dNTP، ۵۰ میکرومول پرایمر ، ۵/۱ واحد پلیمراز تک (Taq پلیمراز از سیناژن) ، ۸ میکروگرم آلبومین سرم گاوی و ۵۰نانو گرم DNA الگو (و یا ۲ میکرولیتر از

سوسپانسیون سلولهای پاره شده با پتاس) و %۵ دی متیل سولفوکسید بود. تکثیر با برنامه دمائی ۵ دقیقه در C°۹۵ و ۳۳ چرخه ۱ دقیقه در C° ۹۴، ۱ دقیقه در C°۵۲و ۵ دقیقه در C°۶۵ در ترموسایکلر (Personal Cycler,Biometra) انجام شد . طول قطعات با نگهداری نمونه ها در C°۷۲ به مدت ۱۰دقیقه افزایش داده شد. نمونه ها در دمای C°۲۰- تا زمان الکتروفوروز نگهداشته شدند.
الکتروفوز DNA
الکتروفوز قطعات DNA تکثیر شده در ژل %۸ پلی اکریل آمید و در بافر تریس – برات EDTA(TBE ، ۸۹ میلی مولار تریس ، ۸۹ میلی مولار اسید بوریک ، ۲ میلی مولار EDTA ،۲/۸ PH ) انجام شد. نمونه ها (۱۰ میکرولیتر پس از اختلاط با ۱۰ میکرولیتر بافر TBE حاوی ۱/۰ درصد برم فنل بلو و ۵

۰ درصد گلیسرول در چاهک های ژل (۱/۰ × ۲۰ ×۲۰ سانتی متر ) ریخته شده و الکتروفروز در شدت جریان ثابت ۲۰ میلی آمپر تا رسیدن برم فنل بلو به انتهای ژل انجام می گرفت . ژل با نیترات نقره رنگ آمیزی شده (Haas et al.1994) .واز ان عکس گرفته شد.
AFLP
AFLP(Amplified fragment length polymorphism)به روش ساده کلرک و همکاران (Clerc et al.1998 ) با مختصر تغییری انجام شد. آغاز گرها طبق توصیه کلرک و همکاران به صورت منفرد به کار برده شدند ولی با ارزیابی مخلوط های دو آغاز گر مختلف ، در یک ترکیب دوتائی (پرایمرهای ۳ و ۷ کلرک و همکاران ) تعداد قطعات تکثیر شده چند برابر گردید . قطعات تکثیر شده در ژل پلی الکریل آمید %۸ عمودی در بافر TBE الکتروفورز و ژل با نیترات نقره رنگ آمیزی شد.
تعیین شباهت و گروه بندی جدایه ها
شباهت جدایه ها با مقایسه نقوش قطعات DNA در ژل وجوددارد و عدم وجود قطعات همسان در دو جدایه و تعیین ضریب تشبه ژاکارد (Jaccard coefficient) صورت گرفته، ماتریکس تشابه و دندروگرام با روش مقایسه جفت ها از طریق میانگین های بی وزن (unweighted pair group method whit arithemetic averages,UPGMA) با نرم افزار SPSS.V9 محاسبه و ترسیم گردید.
آزمون بیماریزائی
بذور چغندر لبوئی و چغندر در شرایط گلخانه ( دمای ) در گلدان های محتوی خاک شنی لومی کاشته شدند. بوته های چغندر در مرحله ۱۰-۶ برگی برای مایه زنی به کار رفتند. بوته ها ۴۸ ساعت قبل از مایه زنی در زیر کیسه های پلاستیکی (سلوفان ) نگهداری شدند. جدایه های مورد بررسی روی محیط NAG به مدت ۴۸ ساعت ودر دمای کشت و چگالی نوری سوسپانسیون باکتری در آب مقطر استریل به ۰۱/۰ واحد د ر۶۰۰ نانومتر تنظیم شد. سوسپانسیون حاصله به کمک

سرنگ به پشت برگ ها مایه زنی گردید. یک دسته از گیاهان نیز به صورت زخم کردن برگ ها با سنجاق و سپس پاشیدن سوسپانسیون باکتری روی گیاه مایه زنی شد. بعد از مایه زنی، بوته ها مجدداً در زیر پوشش پلاستیکی تا ۴۸ ساعت قرار داده شده و پس از برداشت جهت ارزیابی روزانه در گلخانه نگهداری گردیدند. برای بررسی واکنش بیماریزائی یا فوق حساسیت ، برگ های شمعدانی (Pelargonium×hortorum) ، گندم (Triticum aestivum L.) و گوجه فرنگی (Lycopersicon esculentum Mill) نیز با سوسپانسیون کدر باکتری (OD های ۱ و ۱/۰ ) تزریق

گردید. یک جدایه P.s syringae(جدایه عامل شانکر هلو ) نیز در آزمون های بیماریزائی روی گندم ، چغندر و نهال هلو (Prunus persica L. Alberta) به کار رفت .
نتیجه
۱-جداسازی و تعیین ویژگی های فنوتیپی
از کشت نمونه های چغندر دارای علائم لکه برگی و سوختگی برگ که از چند مزرعه در حومه بابل جمع آوری شده بود و جدایه هائی با کلنی های محدب سفید رنگ تا بژ و لعابدار روی محیط NAG به دست امد . قطر کلنی ها بعد از دو روز در دمای حدود دو میلی متر و بعد از سه روز حدود سه میلی متر و با حاشیه صاف بود. سیزده جدایه با مرفولوژی کلنی مشابه که در محیط King B (King et al.1954) تولید رنگدانه محلول فلورسانت کردند انتخاب و برای تعیین ویژگی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی به کار برده شدند. جدایه ها گرم منفی میله ای شکل ، متحرک ، هوازی ، کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی بودند. واکنش تمامی جدایه ها در آزمون تولید لوان، ذوب ژلاتین، هیدرولیز کازئین و ۸۰ Tween و تولید بتاگلوکوزید از مثبت بود. این جدایه ها اریترول ، مانیتول ، گلیسرول، فروکتوز ، لاکتات و دی – تاتارات استفاده کرده ولی توانائی استفاده از دولسیتول ، مالتوز ، رامنوز وال-تارتارات را نداشتند . سایر ویژگی های فنوتیپی جدایه ها در جدول ۱ خلاصه شده است.
بیماریزائی
چهارتا پنج روز پس از مایه زنی باکتری در پهنک برگ ها لکه های کلروزه ای ظاهر شد. این لکه ها که در مرکز آبسوخته و نیمه شفاف (translucent) بودند بتدریج گسترش یافته و از وسط نکروز شدند. لکه ها نکروزه به رنگ قعهوه ای تیره تا سیاه در آمده و آبسوختگی به همراه هاله کلروزه در اطراف آنها وجود داشت . گسترش لکه ها نسبتاً سریع بوده و ظرف ۱۰-۷ روز پس از بروز ، بخش وسیعی از پهنک برگ نکروزه شد.جدایه ها علائمی را پس از مایه زنی در گوجه فرنگی و گیاهچه های گندم ایجاد نکردند ولی تزریق سوسپانسیون باکتری به برگ این گیاهان منجر به بروز واکنش فوق حساسیت گردید. یک جدایه p.s syringae(جدایه عامل شانکر هلو) در چغندر علائمی را ایجاد نکرده ولی در گندم لک های نکروزه و در هلو شانکر ایجاد نمود . باکتری مایه زنی شده مجدداً از بوته روی محیط NAG جدا سازی گردید.

نقوش قطعات تکثیر شده با BOX-,ERC-PCR
نقوش تکرار پذیری از قطعات DNA تکثیر شده با آغاز گرهای BOX,ERIC2,ERIC1
AIR در تمامی جدایه ها به دست آمد. شباهت جدایه های ب دست امده از چغندر با جدایه استاندارد P.s aptata به ترتیب ۹۰،۹۲،۹۶ در صد بود. در نقوش به دست امده با ۳ آغاز گر ، شباهت جدایه های چغندر و P.s aptata با P.s syringae ، P.s. tomato و P.s. maculicola بین ۷۵ تا ۸۱ درصد برآورد گردید. جدایه های چغندر در سطح شباهت ۸۰ درصد با جدایه p.s syringae

(عامل شانکر هلو) دسته بندی شده و این خوشه (کلاستر) ذدر سطح ۷۵ درصد با جدایه ای P.s. tomato و P.s maculicola گروه بندی شدند. در BOX-,ERC-PCR ، هر سه روش تهیه DNA الگو از جدایه های مختلف نمونه های DNA تهیه شده با هر سه روش قابل تکثیر بوده و تفاوتی بین نقوش الکتروفورزی قطعات تکثیر شده ، یک جدایه وجود نداشت . در این مقایسه هم جدایه های مختلف به دست آمده از چغندر و هم جدایه های مرجع به کار برده شدند. در تکرارهای بعدی واکنش های

PCR از سوسپانسیون سلول های پاره شده به کمک پتاس ، بدون نیاز به سانتریفیوژ یا خنثی کردن نمونه (به عنوان نمونه DNA الگو ) استفاده شد.
نقوش قطعات تکثیر شده به روش AFLP
در تکثیر قطعات DNA به روش AFLP ساده (Clerc et at.1998) با هر یک از آغازگر ها ۴ تا ۶ قطعه به دست آمد. با به کارگیری برخی از آغازگرها به صورت دو تائی تغییری در نتیجه حاصل نشد ولی یک مورد افزودن دو آغازگر (آغاز گرهای ۳ و ۷ کلرک و همکاران ) به مخلوط واکنش منجر به تولید قطعات بیشتری با طول های متفاوت گردید . شباهت جدایه های چغندر با جدایه استاندارد p.s

aptata 95-94 درصد در سه تکرار مختلف بوده و این جدایه ها ، یک خوشه (کلاستر) جدایی را از جدایه های P.s maculicola و P.s tomato تشکیل دادند. دو پاتوار اخیر در سطح %۷۵ با خوشه چغندر – P.s aptata متصل شدند. با استفاده از DNA های استخراج شده با فنل و کلروفرم و نیز سوسپانسیون سلولهای پاره شده با پتاس و سانتریفیوژ به عنوان DNA الگو ، قطعات تکثیر یافته مشابهی به دست آمد . بر عکس ، قطعات ،تکرار پذیری با به گارگیری سوسپانسیون جدایه ها که با پتاس تیمار شده بود(بدون انجام سانتریفیوژ ) به دست نیامد .

بحث
لگه برگی و بلایت باکتریائی چغندر در مزارع چغندر لبوئی حومه بابل در سالهای ۱۳۸۰ و ۱۳۸۱ دیده شد. باکتری جداشده از برگ های دارای علائم از نظر ویژگی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیائی متعلق به گونه P.syringae (schaad et al.2001,Palleroni 1984) تشخیص داده شد . براساس دامنه منابع کربنی مورد استفاده ، از جمله استفاده از دی – تارتارات لاکتات و اریتریتول و نیز ایجاد علائم بلایت در چغندر و عدم ایجاد علائم در نماینده هائی از میزبان های P.s syringae(هلو وگندم ) ، باکتری عامل به عنوان P.s.pv.aptata شناسائی گردید(Whitney & Duffus,Bradbury 1986.schaad et al.2001

Morris et al.2000,1986) . با توجه به عدم امکان شناسائی دقیق پاتوارهای P.s syringae براساس ویژگی های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی ومشابه بودن دست کم چند پاتوار از نظر این خصوصیات (Gardan et al.1999 ,yong & Triggs 1994 ,Morris et al.2000) شناسائی عمدتاً بر پایه بیماریزائی در چغندر و ایجاد علائم بلایت و سوختگی با گسترش سریع صورت گرفت. در بررسی بلایت باکتریائی طالبی (Cucumis melo L. var.cantalupensis Naudin) در فرانسه که مشخص گردید عامل آن P.s.aptata است، نیز شناسائی پاتوار عمدتاً براساس بیماریزائی در چغندر صورت گرفته است(Morris et al.2000)، خصوصیات فنوتیپی ، سرولوژیکی و پروفیل پلاسمیدی قادر به شناسائی پاتوار ایجاد کننده بلایت نبوده اند. در بررسی این متخصصین انگشت نگاری بااغاز گر BOX نیز در موارد ، به ویژه شناسائی و تمایز جدایه های P.s. syringae کارائی نداشته و نهایتاً جدایه های عامل سوختگی برگ طالبی براساس قابلیت ایجاد سوختگی برگ در چغندر شناسائی شده ولی انگشت نگاری BOX تا حد زیادی تأیید کننده انتساب به پاتوار P.s aptata بوده است. در بررسی حاضر شناسائی عامل بلایت چغندر به عنوان P.s.aptata با مقایسه نقوش قطعات DNA ژنومی تکثیر شده با استفاده از آغازگرهای ERIC وbox و با روش AFLP ساده

(Clerc et al.1988) تأیید گردید. اثر انگشت به دست آمده با آغازگرهای ERIC1 و ERIC2 جدایه های عامل بلایت چغندر و جدایه استاندارد P.s aptata بین ۹۰ تا ۹۲ درصد مشبه بوده و درصد تشابه آنها از طریق نقوش به دست آمده با آغازگر BOX تا حد %۹۶ بود. نقوش حاصل ازاین آغازگرها ، به ویژه BOX به خوبی جدایه های منتسب به P.s aptata را از جدایه های P.s tomato وmaculicola P.s ( با حداکثر شباهت %۷۵ ) و P.s syringae (با حداکثر شباهت %۸۱ ) متمایز نمود.