چشم پوشیدن از اگزون القائی تحت فشار سرما در یک گونه از ژن انورتار سیب زمینی

دپارتمان سلول و ژنتیک مولکولی، نماد تحقیقات محصولات اسکاتلندی
چکیده :
ما نشان می دهیم که دو ژن انورتار در سیب زمینی مانند بیشتر دیگر، ژن های انورتار گیاهان، شامل یک اگزون بسیار کوتاه ثانویه با bp 9 است که سه آمینواسید مرکزی از یک طرح کاملاً حفظ شده در انورتارهای با اصل و مبداء متنوع، را کدگذاری می کند. این مبنی اگزون، یکی از کوچکترین اجزاء شناخته شده در گیاهان است و Pre – mRNA حاصل از این ژن ها ممکن است نسبت به

پیوند اتصال متفاوت، حساس و آسیب پذیر باشند چون یک شرط بالقوه برای تعامل ویژه با سیستم پیوند اتصال برای اطمینان از فرایند درست در جهت تولید یک mRNA کامل و بالغ وجود دارد. هیچ مدرکی دال بر پردازش بعد مشخص سازی انحرافی در طی نمود ژن انورتار عادی در سیب زمینی مشاهده نشد. صحت پردازش Post – tr – nscrptional مربوط به pre – mRNA از یکی ژنها توسط فشار ناشی از سرما مشوش شده که منجر به حذف مین اگزون از برخی از گونه ها شده است.

این رویداد پیوند اتصال متفاوت، تحت فشار سرما هم در برگ و هم در ساقه به وجود می آید ولی با ضربه یا آسیب القاء نمی شود این خود یک نمونه چشم نوشیدن اگزون و القای پردازش مختلف تحت فشار سرما بر شمار کوچک از گونه ها را اضافه می کند که برای نمایش اتصال پیوند متفاوت، در گیاهان نشان داده شده اند. حساسیت متنوع فرایند Post – tr – nscrptional به فشار سرما برای دو گونه بررسی شد که به تشریح شرایط زنجیره هسته ای، برای اتصال صحیح آنها امکان خواهد داد.

مقدمه :
در گیاهان شکاف و تقسیم سوکوروز به گلوکز و فروکتوز می تواند با انولیتار یا سنتز سوکروز کاتالیز شود این آنزیم ها برای متابولیسم سوکروز مهم بوده و بنابراین در فرایندهای فیزیولوژیکی اساسی مشمول می باشند یعنی در هر دوی گیاهان کلی و سطوح سلولی نظیر تعامل فسج – حفره و تقسیم کربوهیدارت (۴ . ۳ ). انورتار می توانند به دو گروه خنثی (سیتومولیک) و اسیدی (واسولار و اسوپلاستیک) تقسیم شوند. انورتارهای اسیدی از انواع گسترده ای از گیاهان گرفته شده اند (برای تالیف مراجع به ۷/۶ مراجعه کنید) و با بسیاری کلون های ژنومی و CDNA هم ایزوله شده که در برخی گیاهان توسط خانواده یا گروهی از ژن های مرتبط کدگذاری می شوند (برای مثال ۹/۸ )

زنجیره آمینو اسیدی اشتقاقی آشکار می کند که پروتئین های انورتار گیاه، شماری از حالات کاملاً حفظ شده با یگویگو و با انورتارهای به دست آمده از مخمر و با باکتری را سهیم می کنند. اینها شامل یک حالت جایگاهی فعال بالقوه (WECPD) و یک حالن کاملاً مشخص (NDPNG/A) هستند که ممکن است در مکانیزم کاتالیزی شرکت کنند که نزدیک پایانه N پروتئین قرار دارد. این حالت دوم در پایگاه داده ای پروتئین به عنوان حالت مشخص B – Pruct . sihse (برای مثال PRO – Site )

مشمول شده است ویژگی کلون های ژنومی گیاه که از انوتارها را کدگذاری می کنند، به استثنای یک مورد خاص نشان داده که هسته مرکزی این طرح (DPN) با یک مینی اگزون bp 9 کدگذاری می شود. این یکی از کوچکترین اگزون های شناخته شده در گیاهان است. در سیستم های حیوانات یک ارتفاع یا طول اگزون کوچک با bp 51 برای ترفیع اتصال پیوند درست ارائه شده است. در مورد اگزون های کوچکتر که معتبر برای اتصال پیوند انحرافی (کج) هستند، از مجاورت مکان های اتصال پیوند ‘ ۵ و ‘ ۳ به وجود می آیند. در شمار خاصی از حیوانات و تعداد کمی از گیاهان، اگزون ها کوتاه تر از این حد هستند و پیشتر پیشنهاد شده که این اگزون های کوتاه تر ممکن است به مکان های اتصال پیوند نیاز داشته باشند که قویتر از حالات عادی و یا اضافی ای هستند که عناصر را برای شناخت صحیحشان قادر می کنند. انواعی از رویدادهای اتصال پیوند متفاوت (شامل حفظ اینترون، مکان های اتصال پیوند مختلف ‘ ۵ و ‘ ۳ ، چشم پوشی از اگزون و غیره ….) در سیستم های حیوانات کاتالوگ بندی شده است. چنین رویدادهائی برای منجر شدن به ترکیب پروتئین های مختلف نشان داده شده که ممکن است در عملکردشان با توزیع بافت متفاوت باشند. رویداد کاملاً هستند از اتصال پیوند متفاوت پیشنهاداتی را توسعه داده که یک مکانیزم متفاوت را پایه گذاری می

کند طوری که در آن تنظیم نمود ژن می تواند تحت تاثیر قرار بگیرد. در گیاهان فقط نمونه های کمی از اتصال پیوند متفاوت توصیف شده است. چند مثال از رویدادهای پیوند ‘ ۵ متفاوت شناخته شده برای مثال در گونه های برای rabisco activase در اسفناج و آرپیدوسپیس (۱۴) و جو (۱۵)، برای پروتئین محدود کننده RNAI در تابوکو (۱۶) و برای سنتز Chorismate در گوجه فرنگی (۱۷) پیوند متفاوت ‘ ۳ در پردازش گونه های ژن P ذرت (۱۸) و کدگذاری پروتئین Fla Vevia trinevia H روی می دهد فرایند متفاوت گونه برای سنتز نشاسته خره ای در برنج می تواند منجر به حفظ انتیرون ۱ در حالت کامل و رسیده شود. با ارائه اندازه کوچک مینی اگزون در ژن های انورتار گیاه، گونه های آنها موارد کاندیدی برای پیوند مختلف هستند که منجر به حذف زنجیره رمزگذاری شده توسط مینی اگزون از mRNA کامل و تبدیل به یک پلی پپتید جهش یافته می شوند که فاقد هسته B – Pruct . sihse است. این احتمال باعث شده که بروز نموده از ژن های انورتار در سیب زمینی برای

رویدادهای پیوند متفاوت را بررسی کنیم. ما شرح می دهیم که پیوند مختلف می تواند با فشار تحت سرما القاء شود و اینکه یک اثر متفاوت در طی نمود دو ژن انورتار گیاهی بررسی شده است.

PCR ژنومیک :
DNA از برگ Sola nam tobersam و با فرایند اشتقاق شامل یک مرحله الکلی SDS Lysis ایزوله می شد. آلیکوت های ng 30 به عنوان نمونه در یک سنجش PCR با حجم کلی ۵۰ شامل ۱ از هر یک از ‘ ۵ و ‘ ۳ بر پیمرها استفاده می شدند. (برای Amw6 , AmwT1 , CD111 ، برای Amw2 m , AmwT4 , CD141 ) ( mh 2/0 از mm , dNTP 5/1 کلرید منزیم، mm 50 کلرید پتاسیم و nm 20 Tro – Hcl یا PH 4/8 و uTaq1 پلی مری ) PCR برای حدود ۴۰ چرخه (c 95 در یک دقیقه، ۶۵

درجه یک دقیقه و ۶۵ درجه و یک دقیقه و c 72 در سه دقیقه به ازای هر چرخه) با یک امتداد نهائی ۷۲ درجه ای به مدت ۵ دقیقه انجام شد. محصولات واکنش یا عزل آگاروز الکتروفورسیس و تحلیل شده و محصولات خاص به دست آمده در PGEm – T (پرومگا) کلونی شده و در هر دو جهت متوالی می شوند.
PT – PCR :
RNA کلی از برگ و ساقه Solamum tubersum به دنبال روش اسکرو درات آال ایزوله شده. DNA آلوده با کشت uRQ1 DNase (مجزا از RNase ) در mm 10 10 تریس کلرید هیدروژن وب هاش ۸ ، mMEDTA 1 شامل URNase 72 عامل مانع برای مدت ۲۰ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی گراد به دنبال رسوب RNA و تکرار این عمل خارج می شود (جدا می شود). آلیکوت های ۲ از RNA کلی (مجزا از DNA ) با u 200 ترانس کرپتیاس تضاد اندیس بالا، در یک حجم نهائی از ۲۵ کلرید پتاسیم mm 75 ، mm 3 کلرید منیزیم، mm 10 از DTT و mm 50 و کلرید هیدروژن Pris با PHA در ۴۲ درجه سانتی گراد به مدت ۴۵ دقیقه و در حضور mm 1 dNTP و ۵/۰ از پریمر ۳ متن

اسب (برای CD111 , 111R ، برای CD141 , 141R ) به صورت متضاد رونوشت می شود.
نمونه هائی از از این واکنش برای فراهم کردن نمونه و الگوی CDNA برای PCR به کار می رفت که از همان پریمر ‘ ۳ با پریمر مناسب ‘ ۵ [ برای CD111 ، نوع ۱۱۱F ، برای CD141 نوع ۱۴۱F ] استفاده می شد و با P 32 پایان یافته و به صورت توصیف بالا به کار می رفت. شرایط PCR ، ۳۵ چرخه ۹۴ درجه سانتی گراد در مدت ۱ دقیقه، ۶۰درجه در ۲ دقیقه و ۷۲ درجه در ۳ دقیقه بوده که با یک مقدار نمائی در ۷۲ درجه برای مدت ۵ دقیقه دنبال می شد. محصولات RT – PCR با فرایند الکترو

فروسیس در ۶ درصد پلی اکرپلآمید و ۱۰ درصد ژل های فورمامید برطرف شده و با رادیوگرافی خودکار بررسی می شوند. محصولات به دست آمده با استفاده از پریمرهای CD111 از ژل پلی اکریل آمید الوت شده و به عنوان لایه فرعی برای آزمایشات PCR با استفاده از این پریمرها و با شرایطی مانند شرایط اعمالی برای PCR ژنومی استفاده می شد، به استثنای اینکه یک دمای منسجم ۶۰ درجه ای و ۳۵ دایره (چرخه) در آن و بکار می رفت. محصولات خاص از این واکنش به صورت PGEM – T کلونی شده و در هر دو مسیر متوالی می شوند.
شرایط فشار :

آزمایشات فشار بر روی گیاهچه ها در کشت بافتی رشد یافته بر حالت متوسط ۳۰ – ms تحت یک چرخه ۸/۱۶ ساعته روز به شب در دمای ۲۵ درجه سانتیگرادی انجام شدند. سه هفته بعد از کشت نوعی بندهای آپیکال، گیاهچه ها تحت فشار سرما یا ضربه قرار گرفتند. در مورد فشار سرما این گیاهچه ها به یک بخش رشد انتقال یافته و در ۴ درجه سانتی گراد نگه داری می شدند. البته با شرایط دیگر مشابه با مواردی که قبلاً توصیف شده گیاهچه ها بعد از ۰ (کنترل) ، ۶ ، ۲۴ و ۴۸ ساعته برداشت می شوند (کشت) برای بهبود (بازیافت) بعد از ۴۸ ساعت در دمای ۴ درجه، گیاهچه ها به دمای ۲۵ درجه به مدت ۲۴ ساعت، قبل از کشت منتقل می شوند برای فشارهای ناشی از ضربه برگ های گیاهان با یک چاقوی تیزاستریل شده بر روی تمام سطح خراش داده می شوند و بعد از ۴۸ ساعت کشت می شوند.
نتایج :
سازمان دهی ژن های انوتار در گیاهان :
امروزه کلونی های ژنومی که از هویج، آرابی و پسیس ها، ذرت و گوجه فرنگی جدا شده اند سازمان دهی اینترون آنزیم های انورتار را کدگذاری می کنند، و اگزون تمام اینها با حضور یک اگزون اصل تقریباً kb 1 مشخص می شود که بیشتر پلی پپتیدها را کدگذاری می کنند از جمله مکان فعال ارائه شده، جریان پایین روی این نوع تغییر در اندازه اینترون ها با فقدان آنها در برخی موارد آشکار است (برای مثال یک ژن آربی وپسیس که در آن اگزون اصلی با دو اگزون بیشتر، در ژن های دیگر، نشان داده می شود.)
جریان بالا روی اگزون اصلی یک ویژگی عجیب از این ژن ها، حضور یک اگزون بسیار کوچک فقط در اندازه bp 9 است که در نظام ژن های به استثنای یک ژن در هویج وجود دارد. هر دوی اینترون ها که در کنار مینی اگزون هستند، نشان می دهند که تنوع ارتفاع در این گونه های گیاهی وجود دارد. اگزون bp 9 ، سه آمینواسید با حالت (DPN) B – Fractosidase را کدگذاری می کند که برای شرکت در شکل گیری محل کاتالیزی آنزیم یعنی عملکردی مطابق با درجه بالای آن در حفظ دگرگونی، پیشنهاد کرده است.
هیچ کلون ژنومیکی که انورتار سیب زمینی را کدگذاری می کنند برای ارجاع تاریخ توصیف نشده است با این حال مادو CDNA مختلف (CD111 , CD141) را از برگ سیب زمینی گروه بندی کرده ایم که نشان از دوژن بوده و به طور متفاوت در طی بلوع برگ ظاهر می شوند از این فرض که سازمان دهی اینترون یا اگزون از ژن های سیب زمینی ای که CDNA را کدگذاری می کنند شبیه به سازمان دهی ژن های انورتار است که قبلاً توصیف شده، ما پریمرهائی را برای تشدید و افزایش از ژنوم سیب زمینی یک قسمت، طراحی کردیم که اگزون EI اگزون اصلی برای هر ژن را دربر می گیرد. محصولات PCR که از هر دو گروه پریمری تولید شدند. کلونی شده و توالی نیوکلوتیدی آنها هم مشخص شده در دو بخش ژنی مرتبط به دو CDNA مربوط به سیب زمینی، یک سازمان دهی

مشابه با بیشتر ژن های انورتار دیگر گیاهان یافته شد. (شکل b 1) البته با هر ژن، که یکی مینی اگزون bp 9 داشت در هر دو مورد در کنار یک انتیرون کوچک و بزرگ قرار گرفت.
پیوند متفاوت ژن های انورتار سیب زمینی القائی با فشار سرما :
برای بررسی نظام رویدادهای سیوند متفاوت شامل مینی اگزون از هر یک از ژن های سیب زمین، ما دو مجموعه بیشتر از پریمرها را به کار بردیم که به ویژه برای تشدید با RT – PCR طراحی شده یعنی میان بخشی از گونه های اشتقاقی از دو ژن انوتار سیب زمینی (اگزون ۱ ، اگزون ۳ و اگزون

۲ و اینترون های مجاور آن) در هر دو مورد اگر گونه ها به درستی پیوند بخورند، یک محصول bp 105 به وجود خواهد امد. در حالیکه اگر از اگزون ۲ در یک رویداد پیوندی مختلف چشم پوشی شود، یک محصول متفاوت bp 96 تولید خواهد شد. RNA از بافت هائی ایزوله می شود که هر دو ژن بروز می یابند (برگ و ساقه) و برای RT – PCR بکار می روند ولی هیچ شواهدی دال بر رویدادهای پیوندی مشاهده نشده و فقط با یک محصول خاص bp 105 نشان دهنده پیوند درست، بررسی و آزمایش

می شوند (نتایج نشان داده نشده است) شناخته شده که فشار برای مثال شوک گرمائی می تواند پیوند متفاوت در حیوانات را القاء کند. در سیب زمینی آنزیم های آنورتار در انبوه سازی

شکرهای کاشی (شیرین کننده در حرارت کم) و در تکمه های در معرض ذخیره سرمائی به کار برده می شوند. به همین دلیل، پتانسیل لازم برای پیوند متفوات گونه های انورتار القائی تحت فشار سرما، تمایل ویژه در سیب زمینی است. ما گیاهچه های سیب زمینی را در کشت بافتی برای یک کورس دوره زمانی سرد و یک دوره بازیافت ضخامت با آن قرار دادیم. RNA بر کسی که از هر نقطه زمانی، ایزوله شده به عنوان لایه فرعی برای RT – PCR با همان مجموعه پریمرها که قبلاً توصیف

شدند به کار برده شد. با پریمرها در مقابل گونه های CD111 بعد از ۶ ساعت تحت فشار سرما، در محصول عمده بررسی شدند (شکل ۲ ) یکی از bp 105 و یک محصول ثانویه با bp 96 که نشان از یک محصول بالقوه مختلف است. مقدار این محصول ثانویه با زمان ارائه در فشار سرمائی، افزایش می یابد. با این حال هیچ مدرکی دال بر این محصول کوچکتر بعد از دوره رکاری بررسی نشد. یک محصول بیشتر هم بین دو محصول اصلی در نظام نمونه ها به دست آمد. تمام سه محصول برای بررسی ارتباطشان با محصولات به دست آمده از رویداد پیوندی متفاوت و در بین کلونی شده و متوالی می شوند. (زنجیره وارد شدند) هر دوی محصولات bp 105 و حالت میانی، مرتبط با محصول پیوندی درست هستند همانگونه که از زنجیره CDNA پیش بینی شد و بنابراین محصول میانی ممکن است نشان از یک محصول ساختگی بر خاصیت باشد که از محصول bp 105 تولید می شود.

محصول bp 96 به عنوان یک محصول پیوندی متفاوت تائید شده که فاقد ارتباط bp 9 با اگزون دو می باشد. (شکل ۳ ) با پریمرها و برای گونه های CD141 ، هیچ مدرکی دال بر یک محصول پیوندی مختلف حتی بعد از ۴۸ ساعت تحت فشار سرما بودن بررسی نشده (نتایج نشان داده نشده اند).
خصوصیات پیوند متفاوت :

برای بررسی بیشتر خصوصیت پیوند متفاوت، ما رویدادن آن را در یک بافت مختلف و تحت شرایط فشاری متفاوت جستجو کرده ایم. RNA از بافت ساقه بعد از ۴۸ ساعت فشار سرما، گرفته شده (اشتقاق شدن) و در RT – PCR با هر دو مجموعه از هر پیمرها به کار رفت. به طور مجدد برای گونه های CD111 یک محصول پیوند خورده متفاوت بعد از فشار سرما ولی نه در کنترل گیاهچه ها مشاهده شدند در حالیکه در مورد گونه های CD141 فقط محصول پیوند خورده درست را برای هر

دو مجموعه گیاهچه بررسی کردیم (شکل ۴ ) این نشان می دهد که فرایند مختلف فقط خاص برگ نیست ولی می تواند در بافتی دیگر که این ژن نمود می یابد، روی دهد. برای بررسی یک شرط فشاری متفاوت، ما یک آزمایش خراشی را انجام داده ایم. RNA از بافت خراشی خورده فراهم می شود و بعد به عنوان لایه فرعی برای RT – PCR به کار می رود. در این مورد هیچ پیوند مختلفی برای هر دو گونه مشاهده نشد. (شکل ۴ )
مقایسه زنجیره ها :
ما زنجیره های نیوکلوتیدی هر دو اگزون را تحلیل کرده ایم که برای پیوند صحیح و اینترون های مشمول در این پیوند مهم می باشند. زنجیره های نیوکلوتیدی مربوطه از هر دو ژن، در پایگاه داده ای EMBL با دسترسی به شماره های انباشته می شوند. یکی ویژگی آشکار در زنجیره اگزون وجود یک پنتان کلونید (YAAYG) است که ۴ بار در ژن با کد CD111 تکرار می شود. در پایان اگزون

۱، در اگزون ۲ و دوبار در شروع اگزون ۳ شمار و جایگاه این تکرارها در ژن با کد CD141 به استثنای یک مینی اگزون تغییر می کند جائی که زنجیره AAAT6 پیش می آید. بررسی زنجیره اگزون و ژل انورتار سایر گیاهان در این بخش نشان می دهد که این فرایند تکرار پنتان کلوتید به طور عمده در شمار و جایگاه تغییر می کند. اگرچه تغییر بیشتر در زنجیره هم مشاهده شده، زنجیره های اینترون ۲ کوچکتر در هر دو ژن با محتویات A/T 83 و ۸۱ درصد در انتهای فوقانی رنجی از محتویات Au برا

ی اینترون های دی کوتیلون قرار می گیرد. تغییر Au / Gc محدوده های اینترون / اگزول ممکن است نشان از یک سیگنال مهم در شناخت اینترون گیاه باشد و محتویات بالای Au از این اینترون ها، تغییر عمده در این اندازه گیری از زنجیره های محاصره کننده اینترون ۱ و اگزون ۲ در یک طرف و اگزون ۳ در طرف دیگر را به وجود می آورد. هر دو اینترون ها شامل مسیر طولانی و غنی از A/T است که در مورد CD111 شامل یک تکرار کامل bp 15 می باشد. زنجیره های شبیه این تکرار هم در نوع CDCI یافت می شدند.