مقدمه

باکتری های اپی فیت، باکتری هایی هستند که توانایی زندگی بر روی سطح گیاهان را دارند، توسط آب و مواد ضدعفونی کننده از سطح گیاهان شسته و حذف می شوند. متعلق به گروه های مختلف فیلوژنیکی، مانند پروتئوباکتریا (Proteobacteria) اکتینوباکتریا((Actinobacteria وگرم مثبت های دیگر (Firmicutes) می باشند .(Rusenblueth, 2006)

میکروارگانیسم ها بخش جدایی ناپذیر از اکوسیستم ها بوده و فعالیت های

محرک رشدی گیاه در آن ها به مکانیسم های مختلفی مانند انحلال فسفات آلی (الیویرا و همکاران، ۲۰۰۹ )؛ (احمد و همکاران، (۲۰۰۸ تثبیت نیتروژن (احمد و خان، (۲۰۱۱ و سنتز ایندول استیک اسید (صادقی و همکاران، ( ۲۰۱۲ نسبت داده می شود. برای حصول به کشاورزی پایدار، توجه روز افزونی به استفاده از میکروارگانیسم های محرک رشد گیاه برای افزایش عملکرد محصول و کاهش استفاده از سموم کشاورزی شده است (آدسموی و کلوپر، .(۲۰۰۹ مطالعات

اخیر نشان داده است که محرک های بهبود دهنده رشد گیاه می توانند به ترشح متابولیت های ثانویه نسبت داده شود .(Kobayashi and Palumbo, 2000) بنابراین بررسی اثر متقابل باکتری های همزیست گیاهان با یکدیگر و با میزبان و ارزیابی نقش آن ها به منظور ارتقا رشد و فعالیت آنتاگونیستی حائز اهمیت است.

باکتری ظاهر میشود. با رشد کلنی ها بر روی محیط کشت، تک کلنی ها به محیط کشت جدید منتقل و خالص سازی شد.

۱-۳ بررسی تولید ترکیبات بازدارنده پاتوژن توسط

جدایه های اپی فیت(آزمون کلروفرم)

-۲ مواد و روش ها جدایه آنتاگونیست روی محیط کشت NAS (نوترینت آگار-
۱-۲ جدایه های مورد استفاده سوکروز) به صورت لکه ای کشت شدند. پس از ۴۸ ساعت رشد در
ویژگی های رشدی ۷ جدایه اپی فیت جدا شده از برگ و شکوفه درختان دمای ۲۵ درجه سلسیوس، لایه باکتری از سطح محیط پاک و
سیب و گلابی در ساری ارزیابی گردید. جدایه های B70، B71، B6 جدا تشتک ها در معرض ۵ میکرولیتر کلروفرم قرار داده شدند. سپس
شده از از شکوفه و جدایه های Au31، Au124، Au126، Au130 از تشتک های پتری به صورت باز به مدت یک ساعت زیر اشعه UV
برگ درختان دانه دار جداسازی شدند. نمونه های گیاهی به قطعات قرار گرفتند. ۰/۱ میلی لیتر از سوسپانسیون بیمارگر E.
کوچک خرد و در ۱۰-۵ سی سی آب به مدت ۳۰ دقیقه روی شیکر قرار amylovora حاوی۱۰۷ سلول باکتری در هر میلی متر در تشتک
داده شد سپس با یک لوپ مقداری از این سوسپانسیون برداشته و به روی های پتری پخش شد. پس از ۴۸ ساعت نگهداری تشتک ها در ۲۵
محیط کشت NAS (نوتریونت آگار- سوکروز) کشیده خواهد شد. پس از درجه سلسیوس، قطر هاله بازداری از رشد اندازه گیری شد (Xu
2-3 روز نگهداری در دمای ۲۵ درجه سلسیوس در انکوباتور کلنی های .and Gross, 1986) شده با ۲ میلی لیتر از معرف سالکوفسکی (
۱-۴ بررسی خصوصیات فنوتیپی جدایه ها
از روش های استاندارد به شرح زیر استفاده گردید: ۰/۵ FeCl3 %2 مولار، در محلول %۳۵
آزمون فوق حساسیت در توتون به روش کلمنت و همکاران((۱۹۶۴، آزمون هوازی یا بی ( HCLO4 مخلوط شده و در تاریکی نگه
هوازی (O/F) به روش هیو و لیفسون((۱۳۵۳، آزمون اکسیداز به روش کواکس((۱۹۵۳، داشته شد. چگالی نوری (Optical
آزمون های کاتالاز و احیای نیترات به روش الیوت و دیکی (۱۹۸۴)، تولید رنگ فلورسنت density) هر نمونه پس از ۳۰ و ۱۲۰ دقیقه
روی محیط کشت کینگ- ب (Kings B) به روش شاد((۱۹۸۸، و آزمون های لیستیناز و در ۵۳۰nm خوانده شد.
ذوب ژلاتین به روش مک فادین((۱۹۸۳ انجام شد. ۱-۷ ارزیابی انحلال فسفات

۱-۵ تولید سیانید هیدروژن

از روش آلستروم و همکاران (Alstrom and Burns, 1989) با کمی تغییرات برای ارزیابی تولید سیانید هیدروژن استفاده گردید. داخل هر تشتک پتری حاوی محیط ۱۰۰ Kings B میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری پخش گردید. سپس کاغذ صافی آغشته به محلول زرد رنگ %۲ کربنات کلسیم و %۰/۵ پیکریک اسید، در قسمت درب پتری قرار داده و یک پتری نیز بدون کشت باکتری به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. پتری ها توسط نوار پارافیلم مسدود شدند، تا از خروج هر گونه متابولیت های فرار جلوگیری به عمل آید. تشتک ها به مدت ۴۸ الی ۷۲ ساعت درون انکوباتور قرار داده شدند. در صورت تولید سیانید هیدروژن توسط باکتری، کاغذ صافی آغشته به محلول زرد رنگ به کرم، قهوه ای روشن، قهوه ای تیره و یا آجری تغییر رنگ می یابد، رنگ کرم بیانگر حداقل مقدار تولید HCN و رنگ آجری نشانگر حداکثر تولید HCN می باشد(. (Alstrom and Burns, 1989

۱-۶ سنجش تولید ایندول استیک اسید

از رنگ سنجی (Colorimetry) به روش (Ehmann, 1977) Salkowski برای ارزیابی تولید ایندول استیک اسید استفاده شد، جدایه ها در محیط NA و NB (نوترینت براث) غنی شده با تریپتوفان ۵۰۰) میلی گرم در لیتر) کشت داده شده و به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۲۸ درجه سلسیوس با ۱۲۰ دور در دقیقه روی تکان دهنده الکتریکی انکوباسیون قرار داده شدند. محیط کشت فاقد باکتری به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد. محیط کشت به مدت ۱۵ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ گردید. یک میلی لیتر از پالیده ی جدا

بررسی قابلیت جدایه ها در انحلال فسفات، از محیط Pikovskaya s Agar (عصاره مخمر ۰/۵ گرم، دکستروز ۱۰گرم، کلسیم فسفات ۵گرم، آمونیوم سولفات ۰/۵ گرم، پتاسیم کلرید ۰/۲ گرم، سولفات منیزیم ۰/۱ گرم، سولفات منگنز ۰/۰۰۰۱ گرم، ۰/۰۰۰۱ گرم، آگار ۱۵ گرم) استفاده شد (Gaur, 1990) جدایه ها به صورت لکه روی این محیط کشت داده شده و پس از ۵ روز نگه داری در دمای ۲۸ درجه سلسیوس، قطر هاله ها اندازه گیری شد -۳ نتایج

۱-۳ بررسی اثر آنتاگونیستی

بعضی جدایه ها یک هاله مشخص بازداری از رشد باکتری بیمارگر را پس از ۲۴ تا ۷۲ ساعت از کشت، نشان دادند. قطر ناحیه بازداری در جدایه های مختلف از ۲ الی ۷ میلی متر متفاوت بود(جدول .(۱

جدول -۱ مقایسه توان آنتاگونیستی جدایه باکتری های اپی فیت به دست آمده از شکوفه و برگ درختان سیب و گلابی

بافتی که از آن قطر هاله بازداری ×نام جدایه
جدایه به دست آمده (میلی متر)
×شکوفه سیب ۶× B70
×شکوفه سیب ۷ B71
×شکوفه گلابی ۵/۵× B6
×برگ گلابی ۴ Au31
×برگ سیب ۲ Au124
×برگ سیب ۲ Au126
×برگ گلابی ۳ Au130

۲-۳ خصوصیات فنوتیپی جدایه ها مثبت بود. همه جدایه ها توانایی احیای نیترات را داشتند ولی هیچ
جدایه های Au31، Au124، Au126 و Au130 روی محیط یک قادر به ایجاد واکنش فوق حساسیت در توتون، تولید لوان روی
کینگ- ب رنگدانه فلورسانت تولید کرده ولی جدایه های B70 محیط حاوی %۵ سوکروز و لهانیدن برش های سیب زمینی نبودند.
، نتایج آزمون های فنوتیپی در جدول ۲ خلاصه شده است.
B71 و B6 فاقد این قابلیت بودند. واکنش کسیداز در هر ۷ جدایه
جدول-۲ خصوصیات جدایه های اپی فیت به دست آمده از شکوفه و برگ درختان سیب و گلابی

×آزمون × × کد × × × ×
جدایه
×ها
× B70× B71× B6 Au31× Au124 Au126 Au130
×واکنش گرم – -× -× -× -× -× -×
×تولید رنگ فلورسانت -× -× -× -× – -× -×
×تولید اکسیداز +× +× +× +× +× +× +×
×تولید لوان -× -× -× -× -× -× -×
×کاتالاز +× +× +× +× +× +× +×
×لهانیدن سیب زمینی -× -× -× -× -× -× -×
×احیا نیترات +× +× +× +× +× +× +×
×فوق حساسیت در توتون × × × × × × ×
– -× -× -× -× -× -×
×تحمل نمک طعام %۴ +× +× +× +× +× +× +×
×تحمل نمک طعام %۵ +× +× +× +× +× +× +×
×تحمل نمک طعام %۶ +× +× +× +× +× +× +×
×ذوب ژلاتین -× -× -× -× -× -× -×
تولید لیستیناز × × × × × × ×
-× -× -× -× -× -× -×
×رشد هوازی/بی هوازی × × × × × × ×
×هوازی ×هوازی ×هوازی ×هوازی ×وازی ×هوازی ×هوازی