مقدمه

کشاورزی پایدار به نمون هایی از کشاورزی اطلاق می شود که در آن از تکنیک های ویژه ای استفاده می شود و علاوه بر استفاده مناسب از منابع محیطی، مخاطراتی آنها را تهدید نمی کند. به خاطر هدفی که کشاورزی پایدار دنبال میکند توجه ویژه ای به میکروارگانیسم های کارامد و مفید خاک لحاظ می شود . میکروارگانیسم های ریزوسفری به سه گروه مفید، مضر و بی اثر طبقه بندی شده اند (Whipps, .2001) باکتریهای ریزو سفری که به طور مستقیم و غیرمستقیم اثرات مفیدی در رشد و توسعه گیاهان دارند به عنوان باکتری های ریزوسفری محرک رشد ( Plan Growth Promoting (Rhizobacteria, PGPRشناخته می شوند .(Asghar, 2002) در مقابل باکتری های ریزوسفری که بر رشد و عملکرد گیاهان تاثیر منفی

دارند، باکتری های ریزوسفری مضر یا باکتری های مضر
Rhizobacteria) (Deleterious نامیده می شوند (Kremer,
.Sarwar , 1995) باکتری های ریزوسفری محرک رشد قادرند از روش های مستقیم یا غیر مستقیم بر رشد گیاه اثرگذار باشند. اثر مستقیم شامل افزایش انحلال عناصر غذایی کم محلول مانند فسفر، تولید -ACC د آمیناز، تثبیت نیتروژن و تولید سیدروفور (از دیدگاه افزایش قابلیت جذب آهن )، رهاسازی متابولیت های ثانویه نظیر تنظیمگرها یا هورمون های رشدی و موادی از این قبیل و یا تسهیل جذب عناصر غذایی از محیط رشد گیاه است اما تاثیر غیر مستقیمPGPR ها در تحریک رشد گیاه زمانی رخ می دهد که از اثرات زیانبار یک یا چندین عوامل بیماریزا کاسته یا به کلی بازداشته می شود(.(Ping, Boland, 2004 رقابت برای جذب مواد و اشغال جایگاه های مناسب برای فعالیت پاتوژن ها، تولید آنتی بیوتیک، تولید سیدروفورها، آنزیم های لیتیک و تولید سیانید هیدروژن از مکانیسم های مورد استفاده در این روش می باشند. جنس های مختلفی از باکتری ها جز دسته باکتری های محرک رشد گیاه هستند اما از این بین باکتری های جنس باسیلوس از موثرترین باکتری ها در افزایش شاخص های رشد گیاه می باشند. با وجود اهمیتی که باسیلوس های گرم مثبت اسپوردار به عنوان باکتری های محرک رشد، حل کننده فسفر، تولید کننده انواع هورمونهای تنظیم کننده رشد، افزایش مقاومت گیاهان به شوری و خشکی و مخصوصا توان کنترل بیولوژیک عوامل بیماریزای خاکزی را داشته اند، این جنس از باکتری ها در کشور چندان مورد توجه قرار نگرفته اند واین در حالی است که به دلیل توان اسپورزایی این باکتریها بیش از دیگر انواع باکتری های محرک رشد توان ماندگاری داشته و به راحتی به عنوان کودهای بیولوژیک و مایه تلقیح قابل فرمولاسیون هستند . از طرف دیگر با توجه به وجود کلکسیونی از باکتری های این جنس در مؤسسه تحقیقات خاک و آب، بخش تحقیقات بیولوژی خاک، در این تحقیق بر آن شدیم

که خصوصیات PGPR این جنس از باکتری ها را مورد مطالعه قرار دهیم.

PSB باکتری های حل کننده فسفات های نامحلول (Phosphate solubilizing bacteria) را شامل می شود. باکتری های حل کننده بسیاری در خاک وجود دارد، ولی تعداد این باکتری ها در مقایسه با باکتری های معمول در ریزوسفر گیاهان قابل توجه نمی باشد. بنابراین مقدار فسفر آزاده شده به وسیله این باکتری هامعمولاً به اندازه ای نیست که افزایش کافی در رشد گیاهان ایجاد کند. لذا تلقیح گیاهان با یک باکتری خاص، با تراکم جمعیت بسیار بیشتر از آنچه در خاک یافت می شود لازم است تا سودمندی ناشی از خصوصیت انحلال فسفات آن باکتری در افزایش رشد و عملکرد محلول به طور معنی داری بروز نماید(رودریگوئز و فافا، .( ۱۹۹۹ از جمله عوامل موثر بر تعداد باکتری های حل کننده فسفات در خاک پوشش گیاهی، رطوبت خاک و pH می باشد. در آزمایشی مشخص شد که مناسب ترین دامنه pH برای فعالیت باکتری های حل کننده فسفات ۷/۸ تا ۸/۲ است (زاپاتا، PSB .(1989 به عنوان کود بیولوژیک از سال ۱۹۵۰ مورد استفاده قرار می گرفته است(کوداشو،.(۱۹۵۶رهاسازی فسفر توسط PSB از شکل های تثبیت شده و غیرمحلول یک جنبه مهم از دسترس بودن فسفر در خاک ها می باشد. شواهد محکمی مبنی بر توانایی تغییر فسفر خاک توسط باکتری ها به شکل های در دسترس گیاه وجود دارد. زیست توده ی میکروبی فسفر محلول را در بدن خود جذب می کند و از جذب شدن و تثبیت آن جلوگیری می کند(جورجسن، (۲۰۰۹ .جنس های مهم باکتری های حل کننده فسفات، سودوموناس، باسیلوس می باشد (موتسارا، .(۱۹۹۵

هورمون های گیاهی نقش مهمی در کنترل رشد و توسعه گیاه دارند

.(Frankenberger, Sarwar, 1994) هورمون اندول–۳ استیک اسید((Indole-3-acetic acid که به اختصار IAA نوشته می شود، مهمترین نوع اکسین طبیعی و اولین هورمون گیاهی بود که در سال ۱۹۸۸ کشف شد و علاوه بر گیاهان بسیاری از میکروارگانیسم ها نیز توانایی سنتز آن را دارا می باشند. تولید اکسین توسط باکتری های ریزوسفری به کرات گزارش شده است. تولید اکسین در ریزوسفر به دلیل وجود جمعیت بالای میکروبی و فراوانی سوبسترا در این ناحیه می باشد. گزارش شده که ۸۰ درصد از باکتری های جدا شده از ریزوسفر گیاهان مختلف توانایی تولید IAA را داشته اند (Dobelaere, .2003)

اتیلن یکی از هورمون های تنظیم کننده رشد گیاهی است که در مراحل رسیدگی میوه، فتوسنتز، تنفس، تعرق، جنین زایی، ریشه زایی، تکامل اندام های جنسی، جوانه زنی بذور و بسیاری خصوصیات دیگر گیاه نقش دارد. مشخص شده که اتیلن علاوه بر این اثرات دارای اثرات بازدارندگی در رشد گیاهان نیز می باشد و فرایند پیر شدن در گیاه را تسریع می نماید. میزان اتیلن در شرایط تنشی به میزان قابل توجهی

در گیاه افزایش پیدا می کند و باعث پیری زودرس گیاه می گردد. برخی باکتری های ریزوسفری خاک از طریق مکانیسم هایی که با هورمون گیاهی اتیلن در ارتباطند می توانند باعث افزایش رشد گیاه شوند. در این رابطه میتوان به تولید ریزوبیتوکسین توسط برخی سویه های ریزوبیومی و تولید آنزیم -ACC دآمیناز اشاره کرد. تولید آنزیم -ACC د آمیناز توسط برخی سویه های PGPRعموماً در شرایط اعمال تنش های محیطی بر گیاه اهمیت پیدا می کند و نتیجه نهایی آن، برآیند اثرات متقابل بسیار پیچیده این آنزیم با هورمون های گیاهی وخصوصاً اکسین و اتیلن می باشد. باکتری هایی با توانایی تولید آنزیم-ACC د آمیناز می توانند گیاهان را در برابر اثرات مضر تنش های محیطی چون فلزات سنگین، غرقاب، پاتوژن های گیاهی، خشکی و شوری محافظت کنند.

توان تولید سیدروفور از جمله ویژگی هایی است که بر اساس آن باسیلوس ها را در گروه باکتری های محرک رشد گیاه قرار داده اند. در سال های اخیر توانایی تولید سیدروفور در سویه های متعددی از گونه های مختلف این باکتری ها به اثبات رسیده است. سیدروفورها ترکیب های آلی با وزن مولکولی کم ۵۰۰) تا ۲۰۰۰ دالتون) ولیگاندهای شیمیایی با میل ترکیبی شدید و اختصاصی برای پیوند شدن با آهن سه ظرفیتی هستند. این مواد توسط سلول های میکروبی به منظور مقابله با تنش کمبود فرم قابل جذب آهن (<20ʽM) ترشح و این عنصر را به فرم کلات محلول درمی آورند که در این حالت برای سلول هایی که دارای پذیرنده های غشایی اختصاصی باشند، قابل دسترس می گردد .(۱۹۹۴,Payne;1991,Guerinot) گرچه توان تولید سیدروفور در تمام باکتری های هوازی، بی هوازی اختیاری و همین طور در قارچ ها وجود دارد((Alexander,Zuberer,1991 ولی پتانسیل تولید این مواد در گونه های مختلف میکروبی و حتی در سویه های متعدد داخل هر گونه، بسیار متفاوت است. این پتانسیل از سطح ناچیز و غیرقابل تشخیص با روش های متداول تا مقادیر زیاد در حد چند صد میکرومول تغییر می کند و تنها انواعی که دارای توان تولید بالاتری هستند، می توانند بر قابلیت دسترسی آهن در محیط رشد خود اثر بگذارند.

-۲ مواد و روش ها

بررسی باکتری های دارای توان حل کنندگی فسفات: برای شناسایی باکتری های حل کننده فسفات ، باکتری ها روی پلیت های اسپربر (sperber) تلقیح می شوند. برای این کار از لوپ سوزنی استفاده می شود و باکتری ها از روی محیط کشت باسیل آگار روی پلیت اسپربر برده می شوند. با استفاده از لوپ، باکتری ها به صورت نقطه ای در چهار قسمت پلیت تلقیح می شوند. سپس پلیت ها برعکس شده و به مدت ۴۸ ساعت در انکوباتور قرار می گیرند. برای ارزیابی پلیت ها را در برابر نور گرفته، باکتری هایی که در اطرافشان

هاله شفاف ایجاد کرده اند، توانایی حل کنندگی فسفات را دارا می باشند.

محیط کشت اسپربر شامل مواد زیر است: گلوگز ۱۰ گرم در لیتر، yeats extract به مقدار ۰/۵ گرم در لیتر، CaCl2 به میزان ۰/۱ گرم در لیتر، MgSO4 .7H2O به میزان ۰/۲۵ گرم در لیتر، tricalcium phosphate به مقدار ۲/۵ گرم در لیتر و آگار ۱۰ گرم در لیتر که روی pH حدود ۷/۲ تنظیم می شود.

بررسی توان تولید اکسین: به منظور بررسی توان تولید اکسین، ابتدا باکتریها به مدت ۴۸ ساعت در محیط کشت TSB بر روی شیکر کشت داده می شوند تا سوسپانسیون باکتری به دست آید. محیط

کشت TSB شامل مواد زیر است : ۲/ ۵ گرم در لیتر دکستروز،
۲/۵ گرم در لیتر دی پتاسیم هیدروژن فسفات، ۵ گرم در
لیتر کلرید سدیم، ۳ گرم درلیتر پپتون سویا و ۱۷گرم در لیتر
تریپتون . pH این محیط به روی ۷/۲ تنظیم می شود. سپس ۵۰ میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری توسط سمپلر به ۲۵ میلیلیتر محیط TSB حاوی ۵۰ میکروگرم در میلی لیتر L-tryptophane

منتقل می گردد. بعد از ۴۸ ساعت و در دمای آزمایشگاه،
سوسپانسیون باکتری با دورمعادل ۱۰۰۰۰g سانتریفیوژ و یک
میلیلیتر از محلول بالایی با ۴ میلیلیتر معرف Salkowskiمخلوط
می گردد. این معرف شامل مواد زیر می باشد: ۱۵۰ میلیلیتر اسید سولفوریک غلیظ، ۲۵۰ میلی لیتر آب مقطر و ۷/۵ میلیلیتر ۰/۵ FeCl3. 6H2O مولار .

این مخلوط به مدت ۲۰ دقیقه در دمای آزمایشگاه نگهداری و سپس با استفاده از اسپکتروفتومتر میزان جذب نور در ۵۳۵ نانومتر قرائت می شود. .(Patten and Glick , 2002)

جهت تهیه استانداردها، ابتدا ۱۰۰۰ میلیلیتر از محیط کشت پایه (TSB) تهیه شده، سپس به میزان ۰/۰۵ گرم IAA داخل محیط ریخته شده و به مدت ۲۰ دقیقه روی شیکر قرار می گیرد. سپس از محلول حاصل غلظتهای ۰، ۰/۵، ۱، ۲، ۴، ۶، ۸، ۱۰ میلیگرم در لیتر تهیه شده و میزان جذب نور آنها بوسیله دستگاه قرائت می شود. به همان میزان که به سوسپانسیون باکتری معرف اضافه می شود، به غلظت های مختلف IAA نیز اضافه می شود و یک طیف رنگ قرمز به دست می آید. به این صورت که سری رقت های پایین رنگ روشن و زرد دارند و هر چه به سمت غلظت های بالاتر می رویم، طیف رنگ صورتی و قرمز می شود.

جهت ارزیابی نتایج آزمون، مقدار تولید اکسین هر جدایه با مقایسه مقدار جذب نور آن با منحنی استاندارد تهیه شده از ایندول استیک اسید با نرم افزار اکسل محاسبه می گردد.

بررسی توان تولید آنزیم -ACC د آمیناز: آزمون توان تولید آنزیم -ACC د آمیناز به روش آمیکو و همکاران ( ۲۰۰۵) با کمی تغییرات انجام گرفت. به منظور بررسی توان سویه های مورد مطالعه در استفاده

از ACC به عنوان تنها منبع نیتروژن که می تواند نشانه تولید آنزیم -ACC د آمیناز توسط باکتری باشد، به روش زیر عمل شد: ابتدا باکتریها به مدت ۴۸ ساعت در محیط کشت TSB بر روی شیکر کشت داده می شوند تا سوسپانسیون باکتری به دست آید. سپس ۵۰ میکرولیتر از سوسپانسیون تازه هر سویه به ۲۰ میلی لیتر از سه محیط: DF حاوی ۳ میلی مولار ACC، محیط DF حاوی ۲ گرم در لیتر سولفات آمونیوم ( به عنوان شاهد مثبت) و محیط DF فاقد ACC و سولفات آمونیوم ( به عنوان شاهد منفی) تلقیح گردید. بعد از ۴۸ ساعت انکوباسیون در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد با استفاده از اسپکتروفتومتر میزان جذب نور در ۴۰۵ نانومتر برای هر سه محیط قرائت شد. توان تولید آنزیم -ACC د آمیناز بر اساس میزان رشد باکتری در محیط حاوی ACC در مقایسه با رشد (جذب نور) آن در محیط های شاهد، قابل ارزیابی خواهد بود.

محیط کشت DF شامل مواد زیر است : ۴ گرم در لیترKH2PO4 ، ۶ گرم در لیتر Na2HPO4 ، ۰/۲ گرم در لیتر MgSO4.7H2O ، ۲ گرم در لیتر گلوکز، ۲ گرم در لیتر گلوکنیک اسید، ۲ گرم در لیتر سیتریک اسید و هم چنین عناصر میکرو شامل: ۱ میلی گرم در لیتر FeSO4.7H2O ، ۱۰ میکروگرم در لیتر H3BO3 ، ۱۰ میکروگرم در لیتر MnSO4.7H2O ، ۱۲۴/۶ میکروگرم در لیتر ZnSO4.7H2O ، ۷۸/۲۲ میکروگرم در لیتر CuSO4.7H2O و ۱۰ میکروگرم در لیتر MoO3 با pH تنظیم شده بر روی . ۷/۲

توان تولید سیدروفور: این آزمون براساس روش اصلاح شده الکساندر و زوبرر (۱۹۹۱) با استفاده از محیط CAS Blue Agar انجام گرفت. برای تهیه این محیط چهار محلول به طور مجزا تهیه، استریل و سپس با هم مخلوط شدند.
الف- محلول معرف :Fe-Cas این محلول از اختلاط ۱۰ میلی لیتر FeCl3.6H2O یک میلی مولار (در محلول ۱۰ میلی مولار اسید کلریدریک) با ۵۰ میلی لیتر محلول شامل ۶۰/۵ میلی لیتر Chrome 1/21) Azurol S ( CAS) میلی گرم در میلی لیتر) تهیه شد. این مخلوط ارغوانی تیره به همراه تکان های پیوسته به ۴۰ میلی لیتر محلول آب مقطر شامل ۷۲/۸ میلی گرم Hexadecyl thrimethyl 1/82) ammonium bromide(HDTMA)میلی گرم در لیتر) اضافه شد. محلول آبی تیره به دست آمده اتوکلاو و تا ۵۰ درجه سرد شد.

ب- محلول بافر: برای تهیه محلول بافر، ۳۰/۲۴ گرم PIPES در ۷۵۰ میلی لیتر محلول نمکی حل شد. محلول نمکی شامل ۰/۳ گرم KH2PO4 ، ۰/۵ گرم NaCl و ۱ گرم NH4Cl است. pH این محلول با استفاده از محلول ۵۰ درصد KOH در ۶/۸ تنظیم گردید و سپس حجم نهایی آن به ۸۰۰ میلی متر رسانده شد. مخلوط به دست آمده پس از افزودن ۱۵ گرم آگار اتوکلاو و تا ۵۰ درجه سرد شد.

ج- محلول غذایی: شامل ۲ گرم گلوکز، ۲ گرم مانیتول، ۴۹۳ میلی گرم MgSO4.7H2O ، ۱۱ میلی گرم CaCl2.7H2O ،۱/ ۱۷ میلی

گرم MnSO4.7H2O ، ۱/۴ میلی گرم H3BO3 ، ۰/۰۴ میلی گرم

CuSO4.5H2O ، ۱/۲ میلی گرم ZnSO4.7H2O و ۱ میلی گرم

Na2MoO4.7H2O در ۷۰ میلی لیتر آب مقطر است. این محلول نیز پس از اتوکلاو تا دمای ۵۰ درجه سرد گردید.

د- محلول کازآمینواسید: برای تهیه این محلول، ۳ گرم کازآمینواسید در ۳۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد و سپس به وسیله کاغذ صافی غشایی با قطر ۰/۴۵ میکرون استریل شد.

پس از آماده شدن ۴ محلول بالا، محلول غذایی به محلول بافر و محلول کازآمینواسید اضافه گردید. سپس همراه با هم زدن آرام و بدون ایجاد حباب، محلول معرف Fe-Cas به آن ها اضافه و در پلیت پخش گردید .پلیت های شامل محیط Cas Agar پس از انجماد با تیغ استریل به ۴ قسمت مساوی تقسیم شدند و از سوسپانسیون تازه جدایه ها به اندازه ۵ میکرو لیتر در وسط هر قسمت با روش قطره گذاری تلقیح شدند .توانایی تولید سیدروفور از روی تغییر رنگ آبی به نارنجی و با اندازه گیری هاله نارنجی رنگ تشکیل شده در اطراف کلنی باکتری ها و در فواصل زمانی مشخص ارزیابی گردید .هم چنین قطر کلنی باکتری و نسبت قطر هاله به قطر کلنی نیز اندازه گیری و محاسبه شد .لازم به ذکر است که برای جلوگیری از خطا در نقطه گذاری و هم چنین اختلاف قطر محیط ها در پتری تکرار گذاشته شده و متوسط ۳ تکرار را مقایسه می کنند.