مقدمه

امروزه تأمین و توزیع آب در کشورهاي درحال توسعه هزینه-هاي گزافی را بر دولتها تحمیل میکند. این مسئله بهخصوص در کشورهاي خشک و نیمهخشک اهمیت بیشتري دارد. هر هشتثانیه یک کودك بهعلت بیماريهاي وابسته به آب جان

خود را از دست میدهد (World Health Organization, . 2002) نیمی از مردم کشورهاي درحال توسعه از بیماريهاي وابسته به آب رنج میبرند و هشتاد درصد بیماريهاي عفونی در این کشورها ناشی از آلودگی آبهاي آشامیدنی است (Parry . & Mortimer, 1984) جنسهاي مهم میکروارگانیسمها که سبب بیماريهاي عفونی ناشی از آب آلوده میشوند شامل گونههاي Salmonella sp.، Shigella sp. و E. coli می باشند. لذا شناسایی باکتريهاي بیماريزا و سپس حذف آنها از آب ضروري است .(Taylor & Haris, 1965) ورود فاضلابهاي خانگی، فاضلابهاي مراکز دام و طیور و پساب-هاي کشاورزي به محیط زیست به آلودگی آبهاي زیر زمینی منجر میشود .(Fujioka & Yoneyama, 2001) نهتنها آلودگیهاي میکروبی بلکه عناصر سمی مثل آرسنیک و گازهاي آلایندهاي مثل متان در مناطقی که استخراج انجام می-شود موجب آلودگی آبهاي زیرزمینی میشوند (Megan et

.al., 2007; Obsorna et al., 2011)

آژانس حفاظتی اروپا (EPA) در سال ۱۹۹۸ اعلام کرد عنصر کلیدي در مطالعه منابع آبهاي زیرزمینی، بررسی وجود یا عدموجود آلودگیهاي مدفوعی است که برایناساس اندازه-گیري یکی از سه شاخص مدفوعی یعنی E. coli، Enterococci یا Coli phage باید انجام گیرد. مطابق قوانین، براي آبهاي زیرزمینی حداقل مقدار ۱۰۰ میلیلیتر از هر منبع آب براي یکی از سه شاخص پیشگفته باید بررسی گردد. در این رابطه، آزمونهاي استاندارد شامل دو روش محتمل ترین تعداد (Most Probably Number= MPN) و فیلتراسیون غشایی (Membrane Filtration=MF) است. در این مطالعه، آب شرب شهر بجنورد تحت مطالعه میکروبی قرار گرفت. آب آشامیدنی شهر بجنورد از طریق ۱۷ حلقه چاه موجود در سطح شهر و خارج از شهر تأمین میشود. کلیه آب شرب شهر در تمام

۱۱/۱۱ Nova Biologica Reperta 1 (2): 10-15 (2015)

طول سال از این چاهها تأمین میشود. بررسی میکروبی این منابع ازنظر سلامت آب بهلحاظ ویژگیهاي فیزیکوشیمیایی و میکروبی الزامی است.

مواد و روشها

نمونهگیري از شش ایستگاه شامل سه ایستگاه در خارج از شهر و سه ایستگاه در سطح شهر انجام گرفت. تحلیلهاي فیزیکوشیمیایی شامل اندازهگیري مقدار اکسیژن محلول، pH، کدورت و دما توسط دستگاه هاي پرتابل کالیبره در محل نمونه برداري انجام شد. براي مطالعه میکروبی نمونههاي آب، دقت و سرعت در انتقال نمونهها از اهمیت بالایی برخوردار است تا کمترین تغییر در تراکم باکتريهاي آب رخ دهد، بنابراین، آزمایش MPN از آب مطابق استاندارد انجام گرفت (Eaton, .1995) سپس مراحل آزمونهاي احتمالی، تأییدي و تکمیلی میکروبی انجام شد. باتوجه به لولههاي مثبت، تعداد باکتري از جدول MPN در ۱۰۰ میلیلیتر از آب محاسبه میشود

.(Halvorson & Ziegler, 1933) براي انجام آزمون فیلتراسیون غشایی (MF)، ۱۰۰ میلی لیتر از نمونه آب با استفاده از پمپ خلأ از فیلترهاي غشایی نیتروسلولزي با قطر ۴۷ mm و داراي منافذي با اندازة ۰/۴۵ µm عبور داده شد. سپس فیلتر روي محیط کشت انتخابی قرار گرفت تا شمارش مستقیم باکتري موردنظر انجام گیرد. به منظور رشد باکتريها، فیلترها به محیطهاي کشت انتخابی و اختصاصی انتقال دادهشد (Richard

et al., 2005; U.S. & Environmental Protection .Agency.1985-2002)

آزمونهاي احتمالی و تأئیدي E.coli

براي جداسازي و شناسایی E. coli از روش MPN در مرحله احتمالی، از محیط کشت لوریلسولفات براث استفاده شد. از دماي ۳۵ درجه سانتیگراد به منظور رشد Total coliform و ۴۴/۵ درجه سانتیگراد به منظور رشد Fecal coliform هاي ترموفیل به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت استفاده شد. در مرحله تأییدي، از نمونههاي مثبت مرحله احتمالی به محیط کشت برلیانت بایل گرین لاکتوز براث تلقیح شد و در دماي ۳۵ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت گرماگذاري گردید. در مرحله تکمیلی

یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد ۱، شمارة ۱۰-۱۵ :۲

به منظور تأیید باکتري E.coli از محیط کشت Escherichia (ECD Agar) coli Direct Agar استفاده شد. گرماگذاري این محیط ها در دماي ۴۴/۵ درجه سانتیگراد انجام گردید. محیط هاي کشت به مدت ۲۴ ساعت در دماي ۴۴/۵ درجه سانتیگراد گرماگذاري شد. بعد از گرماگذاري تعداد کلنیها شمارش و تعداد باکتري در حجم ۱۰۰ میلی لیتر از نمونه آب طبق معادله زیر محاسبه گردید:

/۱۰۰ml×۱۰۰ تعداد کلنی هاي شمارش شده CFU/ 100 ml=

آزمونهاي احتمالی و تأئیدي E. faecalis

جداسازي و شناسایی E. faecalis به روش MPN بدین صورت انجام شد که در مرحله احتمالی از رقتهاي مختلف آب، به محیط کشت SF broth تلقیح شد. این محیط کشت در دماي ۴۵ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت گرماگذاري شد. سپس درمراحل تأییدي و تکمیلی از لولههاي مثبت مرحله احتمالی به محیطهاي کشت تأییدي Bile Esculin Azid Agar و Bile Esculin Agar انتقال یافت. این محیطها به مدت ۲۴ ساعت در دماي ۳۵ درجه سانتیگراد گرماگذاري شد و سپس کلنیها تحت بررسی قرار گرفت.

جداسازي باکتري E. faecalis به روش فیلتر غشایی بدین صورت انجام شد که بعد از فیلتراسیون حجم هاي مناسب نمونه هاي آب، فیلترها روي محیط کشت m-Enterococcus agar گذاشته شد و گرما گذاري در دماي ۳۵ درجه سانتیگراد انجام شد. بهمنظور تأیید باکتريهاي مورد نظر از کلنیهاي بهدست-

آمده روي محیط هاي کشت Bile Esculin Azid Agar و Bile Esculin Agar به صورت خطی کشت داده شد. این محیطها به مدت ۲۴ ساعت در ۳۵ درجه سانتیگراد گرماگذاري شد. درنهایت، آزمونهاي تأییدي باکتري E. coli و E. faecalis انجام شد. آزمونهاي افترافی جهت شناسایی و تأیید جدایههاي E. coli و E. faecalis شامل کاتالاز، تحمل نمک، رشد در محیط قلیایی و تحمل دماهاي ۱۰، ۴۵ و ۶۰ درجه سانتیگراد و رشد در %./۱ متیلن بلو براي E. faecalis

۱۲/۱۲ Nova Biologica Reperta 1 (2): 10-15 (2015)

و آزمون هاي کاتالاز، اکسیداز، تخمیر گلوکز، KOH ، IMViC و TSI براي باکتري E. coli انجام گرفت.

نتایج

شمارش تعداد کل باکتريهاي موردنظر با روش MPN انجام شد و نتایج آن در جدول ۱ ارائه شده است. بیشترین تعداد باکتريهاي شاخص با روش MPN در ایستگاه شمارة شش و پس از آن ایستگاه شمارة پنج نشان داده شد. دادهها با %۹۵ اطمینان محاسبه و تحلیل گردید. با استفاده از روش فیلتر غشایی، بیشترین آلودگی در ایستگاه شماره شش مشاهده شد.

مشخصات کلیه ایستگاهها و میزان فاکتورهاي فیزیکوشیمیایی اندازهگیريشده است و نزد شرکت آب و فاضلاب شهرستان بجنورد است. آزمونهاي تأییدي مربوط به تشخیص نوع کلنیها نیز با استفاده از آزمون هاي افتراقی انجام شد.

بحث

در این مطالعه براي بررسیهاي میکروبی آب از دو روش MF و MPN استفاده شد. مطابق مطالعات انجامشده و استاندارد، روش MF مناسبتر از MPN ارزیابی شده است. همچنین بررسیها نشان داده است که استفاده از روش MPN تراکم میکروارگانیسمها را بیش از حد واقعی ارائه میدهد. مطابق بررسیهاي انجام شده افزایش تعداد لولههاي مربوط به آزمون MPN نیز می تواند بر دقت آزمایش بیفزاید. بههرحال این روش، میانگینی از تراکم احتمالی باکتريها ارائه میدهد.

ازآنجا که در روش MF حجم و رقتهاي مختلفی از نمونه قابل ارزیابی است، طیف گستردهتري از باکتريهاي موجود در آب به طور مستقیم قابل جداسازي و شمارش هستند. پیش از این براي شناسایی E. coli و کلی فرمها از آزمون تخمیر لاکتوز در ۴۴˚C استفاده میشده است. اما برخی از سویههاي کلی فرمی مانند بعضی از جدایههاي E. coli قادر به تخمیر لاکتوز نیستند.

علت این امر بیان ژن مربوط به تخمیر لاکتوز تحت عوامل مختلف محیطی همچون دما، محیط کشت، مدت گرماگذاري

یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد ۱، شمارة ۱۳/۱۳ Nova Biologica Reperta 1 (2): 10-15 (2015) 10-15 :2

است .(Hoadly & Dutka, 1977) در سال ۲۰۰۰

دستورالعمل ایزو به شمارة ۱-۹۳۰۸، E. coli را براساس

lactose triphenol tetrazolium chloride trigitol-7 (LTTC) شناسایی کرده است.

امروزه E. coli براساس فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز شناسایی میگردد .(Eaton,1995) سازمان حفاظت محیطزیست امریکا در سال ۲۰۰۲ روش تغییر یافته m-TEC Agar را براي شناسایی E. coli معرفی کرد که در این روش نیز اساس

شناسایی، تجزیه ۴-methyl-umbelliferil-β-

(MUG) D glucoronid است.