مقدمه

سالانه بخش عمده اي از محصولات کشاورزي بر اثر آفات و بیماریهاي گیاهی از بین می روند(.(۱ بیماري باکتریایی شانکر مرکبات بسیاري از گونه هاي مهم مرکبات از قبیل گریپ فروت، برخی پرتقالهاي شیرین، لیموترش و لیموشیرین را آلوده می کند .(۵) باکتري عامل این بیماري

می باشد که داراي

دو تیپ متفاوت A وA* است، اگرچه سویه هاي تیپ A

در اغلب مناطق کشت و تولید مرکبات دیده می شود اما سویه هاي تیپA*، تنها در هند، تایلند و کشورهاي حوضه خلیج فارس ازجمله ایران، شناسایی شده است. نتایج حاصله از مطالعات دیگر نشان می دهد که علاوه بر سویه هاي تیپ A*، سویه هایی با دامنه میزبانی وسیع (تیپ ( A

و تیپهاي متنوع دیگر نیز در کشور وجود دارد .(۲) حفاظت

گیاهان علیه این نوع پاتوژن، توسط ترکیبات مسی و آنتی بیوتیکها مقدور می باشد که هر دو مورد، جزء ترکیبات آلوده کننده محیطی به شمار می رود و در چندین مورد گزارش شده است که این ترکیبات به تولید نژادهاي مقاوم باکتریهاي پاتوژن گیاهی منجر شده اند. در سالهاي اخیر تلاشهاي زیادي براي پیدا کردن آنتی بیوتیکهایی معطوف شده که باکتري نتواند در برابر آن مقاوم شود .(۸)
باکتریوسین ها، پپتید ها یا پروتئینهاي آنتی میکروبیال ریبوزومی هستند که در دنیاي میکروبی پراکنده هستند و توسط باکتریهاي گرم مثبت و گرم منفی تولید می شوند، اغلب باکتریوسین ها اندازه کوچکی دارند ( ۲۰ تا ۷۰ اسید آمینه) و داراي خصوصیات کاتیونی می باشند که سلولهاي هدف را با ناپایداري کامل پوشش غشاي درونی و یا از

۱۱۱

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳

طریق مکانیسمهاي تهاجمی دیگراز قبیل فعالیت DNase، RNase و اختلال در سنتز پروتئینهاي ضروري سلولهاي هدف از بین می برند که در نهایت منجر به مرگ سلولی می شوند(.(۷ باکتریوسین ها سموم قوي هستند که به دلیل فعالیت کشندگی قوي ولی با طیف کشندگی محدود، مورد توجه خاص قرار دارند و نکته قابل توجه این است که باکتریوسین ها براي انسان سمی نیستند (۳) یا سمیت آنها بسیار کم می باشد .(۴) اغلب باکتریوسین ها معمولاً علیه گونه هایی که رابطه نزدیکی با استرین تولیدکننده دارند؛ فعالیت می کنند(.(۱۷ باکتریوسین ها اولین بار توسط A.Gratia در سال ۱۹۲۵ کشف شدند. او در حال تحقیق بر روي فرآیندي براي کشتن باکتریها بود که این امر منجر به پیشرفت آنتی بیوتیکها و کشف باکتریوسین ها گردید.

همه این یافته ها به چند سال اخیر محدود می گردد و این نشان دهنده اهمیت کشف باکتریوسین ها می باشد. او اولین کشف خود را کولیسین نامید زیرا باعث کشتن E.Coli گردید (“کولیسین” به معنی کشنده E.Coli می باشد) و جالب اینجاست که این باکتریوسین از خود E.Coli منشاء می گیرد. امروزه مشخص شده است که باکتریوسین ها یک خانواده بزرگ و متنوع از لحاظ عملکردي را شامل می شوند و در واقع سمومی هستند که در دودمانهاي باکتریایی و آرکی آ یافت می شوند .(۱۶)

روشهاي رده بندي باکتریوسین ها بسیار متفاوت می باشد از جمله بر اساس سویه تولید کننده، مکانیسم کشندگی
(مانند تشکیل منفذ و فعالیت نوکلئازي)، وزن مولکولی و شیمی مولکولی (پروتئینهاي بزرگ، پلی پپتید ها و داشتن آمینواسیدهاي غیرمعمول مانند لانتیونین ها)، نحوه تولید

(ریبوزومی، تغییرات پس ریبوزومی و غیرریبوزومی) رده بندي می شوند(.(۱۰ اغلب باکتریوسین ها در چند مورد از آنتی بیوتیکهاي معمول متفاوتند: باکتریوسین ها یک طیف کشندگی محدودي دارند و بنابراین تنها براي باکتري که از لحاظ تاکسونمی خیلی به استرین تولیدکننده آن باکتریوسین نزدیک باشد سمی می باشند. از دیگر تفاوتهاي

مهم میان باکتریوسین ها و آنتی بیوتیکها این است که اغلب باکتریوسین ها منشاء ریبوزومی دارند و ترکیبات پروتئین دار ریبوزومی می باشند. همچنین باکتریوسین ها قادرند در غلظتهاي کم و در حد پیکومول مهار کنند در حالی که آنتی بیوتیکها در حد میکرومول مهار می کنند و در حقیقت این ویژگیها، اکثر باکتریوسین ها را از آنتی بیوتیکها متمایز می کنند(.(۶ تاکنون هیچ گزارشی از باکتریوسین مهارکننده زانتوموناس مشاهده نشده است، باکتریوسین Lashar DGH2 اولین باکتریوسین مهارکننده سویه هاي مختلف زانتوموناس عامل بیماري شانکر مرکبات در ایران و سایر نقاط جهان می باشد. به طور کلی اهدافی که از این تحقیق مورد نظر بوده است عبارتند از شناسایی باکتري مهارکننده رشد باکتري زانتوموناس، اثربخشی این باکتري بر روي باکتري عامل مولد شانکر، امکان دستیابی به باکتریوسین تولیدي توسط باکتري مورد نظر براي مطالعات آتی و بررسی امکان کاهش جمعیت عامل بیماري شانکر مرکبات و کنترل بیولوژیکی بیماري می باشد و همچنین اصول کاربردي از قبیل مبارزه بیولوژیک با آفات و افزایش راندمان تولید مرکبات، بهبود کیفیت میوه از طریق جلوگیري از بروز آفات و بهبود بازار مرکبات از این مطالعه متصور می باشد.
مواد وروشها

سویه هاي باکتریایی و محیط کشت:اندامهاي سالم و آلوده مرکبات و همچنین نمونه هاي خاك و آب از مناطق مختلف استان سیستان و بلوچستان ( شهرهاي نیک شهر، ایرانشهر، چابهار، جکیگور، سرباز، راسک، قصرقند) جمع آوري گردید. بعد از انتقال به آزمایشگاه بلافاصله عملیات جداسازي آغاز گردید جداسازي سویه هاي مختلف باکتریایی بر طبق روش مرسوم در باکتري شناسی انجام گرفت (۱۱) و جهت تولید باکتریوسین علیه سویه هاي مختلف باکتري زانتوموناس ۱۲۰) سویه مختلف) غربالگري انجام گردید. همه سویه هاي شاخص و تولیدکننده در

۱۱۲

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳

محیط کشت مایع (Nutrient Broth) NB کشت داده شدند و از محیط کشت جامد (Nutrient Agar) NA استفاده گردید. از همه سویه هاي بیماریزا (شاخص) و همچنین سویه هاي تولیدکننده استوك با گلیسرول ۲۰درصد تهیه گردید و در -۷۰ درجه سانتی گراد نگه داري شدند.
جداسازي سویه تولیدکننده: بعد از اینکه ۵۰۰ سویه باکتریایی مختلف از منبع باکتریایی مذکور جداسازي و در محیط کشت مایع NB پیش کشت داده شد و بعد از مدت

۲۴ ساعت که از کشت آنها سپري شد هرکدام جداگانه بر روي دیسکهاي مخصوص منتقل و با روش نوین DD-

Disc Diffusion-Agar Well Diffusion ) AWDA (Assay کشت دیسکی داده شدند، بدین ترتیب که سوسپانسیونی از هر باکتري بیماریزا با کدورتی معادل نیم مک فارلند در محیط کشت مایع NB تهیه و به وسیله سواپ استریل روي سطح پلیت محتوي ۱۵میلی لیتر NA

تلقیح گردید سپس دیسک آغشته به ۱۰ میکرولیتر از باکتري تولیدکننده روي سطح پلیت قرار داده شد. پلیتها در دماي ۳۵درجه سانتی گراد آنکوبه و بعد از گذشت ۲۴
ساعت تشکیل هاله عدم رشد بررسی گردید. کلنی تولیدکننده هاله (سویه تولیدکننده) از دیگر کلنیها جدا و جهت بررسیهاي آتی از آن استوك تهیه گردید و تستهاي مورفولوژیکی (میکروبیولوژیکی) و بیوشیمیایی آن انجام شد.

تشخیص و شناسایی سویه جدا شده: سویه جدا شده براي آزمونهاي بیوشیمیایی از قبیل ژلاتین، سیترات، MR و

سایر فاکتورها مورد ارزیابی قرار گرفت و تستهاي میکروبی نیز طبق پروتکلهاي استاندارد انجام شد. شناسایی بیشتر با توالی یابی ۱۶srDNA و به دنبال آن آنالیز فیلوژنتیکی جهت شناسایی سویه تولید کننده انجام گرفت(.(۱۲

تولید باکتریوسین: پیش کشت باکتري تولید کننده بعد از گذشت مدت ۲۴ ساعت آنکوباسیون، سانتریفیوژ گردید(در

دور ۷۰۰۰ × g و به مدت ۱۵دقیقه) و مایع رویی از فیلتر غشایی ۰/۲ میکرومتر عبور داده شد و مایع جمع آوري شده جهت بررسیهاي آتی در یخچال با دماي ۴ درجه سانتی گراد نگه داري گردید.

سنجش فعالیت و تعیین طیف آنتی میکروبیال: روشهاي

مختلفی جهت سنجش فعالیت آنتی میکروبیال باکتریوسین ها وجود دارد که در این تحقیق از دو روش جاسازي در دیسک((Disc Diffusion و جاسازي در چاهک آگار((Agar-Well Diffusion Assay و همچنین از روش نوین DD-AWDA استفاده گردید. در روش Disc diffusion بعد از تهیه پلیتهاي محتوي محیط کشت باکتریایی NA، سطح پلیت با ۱۰۰ میکرو لیتر از باکتري هدف تلقیح ( قبلا از باکتري هدف، استاندارد ۰/۵مک فارلند آماده شد) و دیسکهاي استریل بر روي محیط کشت جامد مورد نظر در پلیت قرار گرفتند و مقدار ۱۰

میکرولیتر از سوسپانسیون باکتري تولیدکننده بر روي دیسک گذارده شد. پلیتها به گرمخانه با دماي ۳۵ درجه سانتی گراد منتقل گردیدند و بعد از ۲۴ساعت تشکیل هاله بررسی گردید .(۱۳) در روش AWDA بعد از تهیه آگار نیمه جامد(۰/۵ درصد) مقدار ۱۰۰ مایکرولیتر از پیش کشت باکتریایی هدف در ۵ میلی لیتر از آن مخلوط شد و در یک پلیت جداگانه که قبلا دو سوم آن با محیط کشت جامد NA پر گردید افزوده و چاهکهایی به قطر ۵ میلی متر در آنها ایجاد و مقدار ۱۰۰ میکرولیتر از سویه تولیدکننده به هر چاهک اضافه شد و به گرمخانه با دماي

۳۵ درجه سانتی گراد منتقل و تشکیل هاله بعد از ۲۴

ساعت بررسی گردید .(۱۴)

استخراج DNA باکتري تولیدکننده: براي استخراج DNA

باکتري تولیدکننده از کیت استخراج DNA ژنومیک

(خریداري شده از شرکت Bioneer، کره جنوبی) استفاده شد و DNA خالص شده جهت نگه داري به یخچال با دماي -۲۰ درجه سانتی گراد منتقل گردید. در پایان براي

۱۱۳

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

اطمینان از کیفیت DNA استخراج شده، جذب نمونه هاي خالص شده در طول موجهاي ۲۶۰و ۲۸۰ نانومتر به وسیله دستگاه طیف سنج خوانده شد.
الکتروفورز :DNA پس از انجام مراحل فوق، براي مشاهده کیفیت DNA استخراج شده ۵ میکرولیتر از آن را روي الکتروفورز افقی ژل آگارز ۱ درصد (تهیه شده در بافر (TBE 1X برده و پس از رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید با کمک دستگاه GBOX HR عکس برداري صورت گرفت .(۱۵)

جدول-۱ برنامه دمایی و زمانی PCR

زمان(ثانیه) دما((°C مراحل شماره

۳۰ ۹۴ Denaturation 1
90 56 Annealing 2
30 74 Extension 3
300 74 Final-Extension 4
– 35 Cycle Count 5

جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳

جدول -۲ غلظتهاي مخلوط PCR (این واکنش در حجم نهایی ۲۵ µl

تهیه شد)

حجم به ʽl غلظت مواد

۱/۵ ۱/۵ mM MgCl2
2/5 10 X Reaction buffer
1 5 mM dNTP(mix)
1 20 pM Reverse primer
1 20 pM Forward primer
2 70ng/ʽl DNA template
15/5 – ddH2O
0/5 1 unit Taq DNA
polymerase

واکنش PCR و : ۱۶srDNA براي تکثیر ۱۶srDNA

مربوط به باکتري تولیدکننده از روش PCR استفاده شد(.(۹

جداول ۱ و ۲ برنامه به کار گرفته شده در دستگاه ترموسیکلر و مخلوط واکنشها را نشان می دهد. ترادف آغازگر forward و reverse به کار گرفته جهت این مطالعه
در جدول ۳ آمده است.