مقدمه

سرخارگل ارغوانی با نام علمی Echinacea purpurea L. هستند. فروش جزئی محصولات این گیاه در آمریکا سالانه
عضو خانواده Asteraceae بوده و به لحاظ جغرافیایی بالغ بر ۱۵۸ میلیون دلار است و در سطح جهانی سالانه
بومی آمریکاي شمالی است. تولید کنندگان عمده آن در ۱/۳ میلیون دلار تخمین زده شده است. پژوهشهاي اخیر
اروپا، کشورهاي آلمان، سویس، هلند، ایتالیا و اسپانیا مؤسسه NAPRALERT، حضور ۲۱۶ ترکیب فعال

۳۱۱

E. purpurea

in vitro

in vitro
مجله پژوهشهاي گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

دارویی در E. purpurea را اثبات کرده است .(۴) سه
گونه از جنس Echinacea که عموماً داراي مصارف

دارویی هستند عبارتند از: ) E. purpurea با مصرف ریشه و قسمتهاي هوایی)، E. angustifolia (با مصرف ریشه) و

E. pallida (با مصرف ریشه) .(۱۷) اسیدهاي فنولیک،

آلکامیدها ، پلی استیلنها ، گلیکوپروتئینها و پلی ساکاریدها به عنوان ترکیبات فعال بیولوژیکی در گونههاي مختلف Echinacea شناسایی شدهاند ۵) و .(۸ به لحاظ دارویی، عقیده بر این است که گیاه سرخارگل میتواند سیستم ایمنی را از طریق تحریک تولید سلولهاي T و

تنفس سلولی (خاصیت آنتی اکسیداسیونی) در برابر سلولهاي تومورزا، فعال کند .(۵)

براي تحقق بخشیدن به افزایش تقاضا براي این گیاه دارویی مهم، روشها و راهکارهاي مختلفی ابداع شده است که شامل تکثیر سریع گیاه در شرایط استریل و به دست آوردن گیاهان سالم و معرفی سریعتر ارقام جدید با صفات مطلوب است .(۱۹) در این خصوص، تکنیکهاي

کشت بافت در محیط بسیار ارزشمند هستند.

اندامهاي تمایز یافته در کشت بافت، سیستم کارآمدي را براي تولید مواد فیتوشیمیایی گیاه سرخارگل ارائه کرده است. در کل، سلول، کالوس و ریشههاي مویی کشت شده

در محیط میتوانند براي مطالعه مسیر بیوسنتزي

مواد فیتوشیمیایی مهم، مورد بهرهبرداري قرار گیرند .(۸)

مطالعات متعددي در زمینه جنبههاي مختلف بهینهسازي سیستم کشت بافت سرخارگل وجود دارد. Koroch و

همکاران ۱۰) و (۱۱ کالوسزایی و اندامزایی غیر مستقیم از ریزنمونه برگ E. purpurea و E. pallida را در غلظتهاي مختلف نفتالن استیک اسید (NAA) و -۶بنزیل آمینو پورین (BAP) مورد بررسی قرار دادند. در گزارش دیگر، Mechanda و همکاران (۱۴)، باززایی مستقیم ساقه

از قطعات برگی گیاهان بالغ را با استفاده از

هورمونهاي NAA و BAP مورد مطالعه قرار دادند. آنها

دریافتند که باززایی در تمامی غلظتهاي BAP که در ترکیب با غلظتهاي پایین NAA بوده رخ داده و غلظتهاي بالاتر NAA نیز کاهش تولید کالوس و عدم باززایی را به دنبال داشته است. باززایی از طریق هورمون TDZ نیز در مورد گیاه سرخارگل در سیستمهاي کشت مایع و جامد گزارش شده که هدف، بررسی نقش هورمون TDZ در القاء باززایی و همچنین توسعه ریزازدیادي در شرایط کشت مایع و جامد براي این گیاه بود .(۹)

هدف از تحقیق حاضر که براي اولین بار در کشور اجرا شده است، بهینهسازي شرایط ریزازدیادي و مطالعه تأثیر غلظتهاي مختلف هورمونهاي اکسین (NAA) و سیتوکنین

(BAP) در میزان کالوسزایی و باززایی گیاه سرخارگل به منظور بررسی پتانسیل نوع ریزنمونههاي این گیاه براي مطالعات آتی در زمینه انتقال ژن به این گونه دارویی مهم بود.

مواد و روشها

براي ضد عفونی، ابتدا بذرهاي سرخارگل (جمع آوري شده از ناحیه مرکزي ایران) در اتانول ۷۰ درصد بمدت ۲

دقیقه و پس از شستشو با آب مقطر به مدت ۷ دقیقه در محلول کلرید جیوه ۰/۱ (HgCl2) درصد قرار گرفتند. پس از ضد عفونی، بذور ۳ الی ۴ مرتبه با آب مقطر استریل در فواصل زمانی ۵ دقیقهاي، تحت شرایط استریل شستشو داده شدند. بذرهاي این گیاه روي محیط کشت MS

(۱۶)(Murashige and Skoog medium) حاوي ۳۰ گرم در لیتر ساکارز و ۷ گرم در لیتر آگار با pH برابر ۵/۸ قرار گرفتند. سپس، نمونهها به اتاقک رشد تحت شرایط ۲۵

درجه سانتیگراد و شدت نور ۴۰۰ لوکس و ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی منتقل گردیدند. مراحل این تحقیق در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزي دانشگاه رازي کرمانشاه انجام گرفت. در فاصله زمانی ۱۵ تا

۲۰ روز، گیاهچههایی به طول ۵-۸ سانتیمتر به دست آمدند. گیاهچههاي مذکور به زیر لامینار ایرفلو منتقل شده

۳۱۲

مجله پژوهشهاي گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

و سپس ریزنمونه هیپوکوتیل به قطعات ۰/۵-۱ و کوتیلدون باززایی شده (شکل (۲ به طور متناوب تحت شرایط
به قطعات ۱×۱ سانتیمتري برش داده شده و به طور استریل از کالوسها جدا و به محیط کشت MS عاري از
متوسط در هر پتريدیش، ۱۰ عدد ریز نمونه کشت داده هورمون منتقل شدند تا در این محیط به حداکثر رشد خود
شد (هر تکرار شامل ۶ پتريدیش). تمامی تیمارها پس از برسند. فراوانی باززایی نوساقه با شمارش تعداد نوساقه
۱۴ روز در محیط مشابه واکشت شدند. پس از گذشت ۱۰ تولید شده به تعداد ریزنمونه کشت شده در هر پتري دیش
روز از واکشت و ایجاد کالوس، کالوسها به محیط باززایی محاسبه گردید. پس از ۳۵-۲۵ روز، گیاهچههایی با طول
(تولید نوساقه) منتقل شدند (شکل .(۱ میزان کالوسزایی حدود ۱۰ سانتیمتر به دست آمدند. گیاهچههاي مذکور به
با شمارش تعداد قطعات کال داده به تعداد کل ریزنمونه- منظور تولید ریشه تحت شرایط استریل به محیط کشت
هاي کشت شده به دست آمد. کالوسها به مدت ۱۵ روز MS حاوي هورمون اندول بوتیریک اسید IBA) به میزان ۲
در محیطهاي باززایی نگه داشته شدند و سپس نوساقههاي میلیگرم در لیتر) منتقل شدند (شکل ۳ الف).

شکل -۱ کالوسهاي در حال باززایی از ریزنمونه کوتیلدون

الف)

شکل ۲ الف و ب- نماي نزدیکی از نوساقههاي تشکیل شده از ریزنمونه کوتیلدون پس از ۵ هفته در محیط باززایی. توجه داشته باشید که پدیده باززایی چندگانه نوساقهها کاملاً قابل تشخیص است.

۳۱۳

مجله پژوهشهاي گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

ب)

شکل – ۳ الف) نوساقههاي منتقل شده به محیط MS حاوي هورمون IBA جهت ریشهدار شدن. ب) انتقال گیاهچهها به گلدانهاي بزرگ جهت رشد و سازگاري بیشتر به محیط آزمایشگاه

سرانجام، پس از گذشت ۴-۶ هفته، گیاهان ریشه دارشده به آرامی از شیشه خارج شده و در زیر شیر آب شستشو داده شدند تا هیچ گونه آگار و بقایاي محیط کشت روي آنها باقی نماند و سپس به گلدانهایی به قطر ۱۰ سانتیمتر شامل ماسه، پرلایت و خاك (به صورت استریل) منتقل شده و در شرایط کنترل شده از نظر میزان رطوبت و حرارت نگهداري شدند (شکل ۳ ب). قابل ذکر است که در چند روز اول میبایست مقدار رطوبت نسبی محفظه بالا نگه داشته شود ۸۰-۹۰) درصد) و از آب مقطر استریل جهت آبیاري گلدانها، استفاده گردد.

محیط کالوسزایی و باززایی شامل ترکیبات مختلف هورمون -۶ بنزیل آمینوپورین ۰ ;BAP)، ۰/۲، ۰/۴، ۱/۲ و ۲/۴ میلیگرم در لیتر) هر کدام در سه سطح (براي هر یک از آزمایشات) و هورمون نفتالین استیک اسید ۰ ;NAA)، ۰/۰۵، ۰/۱، ۰/۳ و ۰/۶ میلیگرم در لیتر) هر کدام در سه سطح (براي هر یک از آزمایشات) به عنوان عاملهاي اول و دوم و نوع ریزنمونه (هیپوکوتیل و کوتیلدون) به عنوان عامل سوم بود. این تحقیق به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با ۳ تکرار اجراء گردید. تجزیه و

تحلیل آماري دادهها با استفاده از نرم افزارهاي SPSS و MSTAT-C انجام شد. قبل از انجام تجزیه واریانس نرمال بودن دادهها مورد بررسی قرار گرفت و تبدیل دادهها

(Arcsin √X) انجام شد. براي انجام آزمون مقایسات میانگین نیز از آزمون چند دامنهاي دانکن استفاده شد.