مقدمه

امروزه عفونت های ناشی از مواد غذایی، یکی از مهم ترین چالش ها برای سلامت عمومی، ایجاد بیماری، گاهی منجر به مرگ و همچنین موجب از دست دادن سرمایه اقتصادی می باشند.[۲] بیماری های منتقله از غذا شامل سندرم حاد و مزمن از شدت و بقای متفاوت چند میکروارگانیسم پاتوژن سبب می شود. نسبت بیماری ناشی از غذا، بواسطه هر دو عامل بیماریزا (گونه / سویه، تلقیح و غیره) و میزبان (سن، جنس، ایمنی و غیره) متفاوت است .[۸] به طور خاص، بقا میکروارگانیسم ها در مواد غذایی می تواند منجر به فساد و خراب شدن کیفیت محصولات مواد غذایی و یا باعث عفونت و بیماری شود. در میان پاتوژن های باکتریایی ناشی ازغذا، سالمونلا انتریکا عمده ترین عامل بیماریزایی از لحاظ میزان مرگ و میر سالانه می باشد[۵,۱۰] که افزایش بیماری سالمونلوسیس در طی دهه ۱۹۸۰ به وضوح در کشورهای توسعه یافته مشاهده شده است.[۷] فعالیت آنتاگونیستی باکتری های اسید لاکتیک در برابر پاتوژن های میکروبی در بین فاکتورهای دیگر ممکن است به مهار آنها کمک کند، که در واقع یک روش مهم برای گسترش طیف وسیعی از غذاهای سالم می باشد.[۲] بنابراین منابع جایگزین ایمن، ترکیبات ضد میکروبی موثر و احتمالا طبیعی یک موضوع استراتژیک تحقیقاتی، درهر دو زمینه پزشکی و صنایع غذایی هستند.[۵] هدف از این تحقیق بررسی اثرات آنتی باکتریال سویه های مختلف لاکتوباسیلوس بر روی باکتری پاتوژن سالمونلا انتریکا می باشد.

مواد و روش ها ۱سویه های باکتری و محیط رشد

سویه های میکروبی استاندارد لاکتوباسیلوس پلانتاروم((ATCC:8014، لاکتوباسیلوس پلانتاروم (ATCC:14917) و سالمونلا انتریکا ( ATCC:1639) بصورت لیوفیلیزه از مرکز کلکسیون قار چها و باکتری های سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران و سویه لاکتوباسیلوس پلانتاروم (ATCC :13643) از آزمایشگاه مرکزی انستیتو پاستور ایران خریداری شدند، محیط کشت های MRS براث (مرک آلمان)، MRS آگار( Himedia هند)، Brain Heart Infushion براث ( Biolife ایتالیا ) ، نوترینت آگار (مرک آلمان) و آگار آگار(مرک آلمان) استفاده شدند.

تولید سوپرناتانت

برای تولید سوپرناتانت، طبق روش از کشت یک شبه سویه ل. پلانتاروم بوسیله لوپ استریل در سرم فیزیولوژی رقیق گردید و برروی همزن قرارگرفت تا کدورت سوسپانسیون معادل نیم مک فارلند ۱/۵ × ۱۰۸ CFU/mlبدست آید سپس از سوسپانسیون بدست آمده در محیط کشت MRS براث کشت داده شد و در انکوباتور شیکردار در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در شرایط بی هوازی انکوبه شد. به منظور جداسازی سوپرناتانت از جسم سلول باکتری ها به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد با دور ۴۰۰۰×g سانتریفوژ شدند. pH سوپرناتانت بدست آمده در محدوده ۶/۵ تا ۷ با ۱ NaOHمولار تنظیم شد. سپس سوپرناتانت از فیلتر استریل ۰/۲ میکرومتر عبور داده شد و توسط روتاری اواپراتور تغلیظ شد. [۹ ]

۲

تعیین فعالیت ضد میکروبی

فعالیت ضدمیکروبی سوپرناتانت جدا شده از سویه ها با روش well diffusion انجام شد. طبق روش از کشت یک شبه سویه شاخص سوسپانسیونی معادل نیم مک فارلند ۱/۵ × ۱۰۸ CFU/mlبدست آمد. برای این آزمون از محیط کشت BHI آگار نرم (حاوی ۰/۷ درصد آگار) استفاده گردید. بعد از رسیدن دمای محیط کشت مذکور حدود ۴۰درجه سانتیگراد از سوسپانسیون بدست آمده سویه شاخص (در غلظت نهایی( ۱۰۷cfu/ml به محیط کشت BHI آگار نرم (حاوی ۰/۷ درصدآگار) اضافه شد. سپس پلیت ها به مدت یک ساعت در دمای یخچال قرار داده شدند تا محیط کاملا جامد گردد. بعد بوسیله پی پت پاستور چاهک هایی با قطر ۶ میلی متر ایجاد گردید. مقدار۱۰۰ میکرولیتر از سوپرناتانت در هر چاهک تلقیح شد. این پلیت ها به مدت ۴ ساعت در دمای یخچال قرارداده شدند تا کاملا سوپرناتانت جذب محیط کشت شود. سپس پلیت ها به مدت ۲۴ – ۴۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. بعد از گذشت زمان مورد نظر، قطر هاله رشد یا عدم رشد مربوط به سویه های شاخص اندازه گیری شد . [۱ ]

تجزیه و تحلیل آماری

در این تحقیق نتایج بدست آمده توسط نرم افزار Spss آنالیز و میانگین ها در سطح احتمال ( P<0/05) مقایسه و در نهایت نمودارها با نرم افزار Excel رسم گردید.
نتایج

نتایج فعالیت ضدمیکروبی سوپرناتانت سویه های ل. پلانتاروم بر باکتری سالمونلا انتریکا درجدول۱ آمده است.

جدول .۱ میزان فعالیت ضدمیکروبی سوپرناتانت سویه های ل. پلانتاروم بر باکتری سالمونلا انتریکا (قطرهاله رشد یا عدم رشد برحسب میلیمتر)

ل. پلانتاروم ۸۰۱۴ATCC 14917ATCC 13643ATCC
آزمون Well diffusion

سوپرناتانت تغلیظ شده ۱/۱۵a 9/33 2/30a 9/33 1/15b 8/67

سوپرناتانت خنثی ۱/۱۵a 7/33 0/00b 6/00 1/15b 7/33

سوپرناتانت غیر خنثی ۱/۱۵a 9/33 1/15a 9/33 1/15a 11/33

*اعداد ( انحراف معیار میانگین ) دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند(P 0/05 .(<

قطرهاله رشد یا عدم رشد با احتساب قطرچاهک ۶)میلیمتر) درنظرگرفته شد.

a a قطر

(
a متر میلی عدم هاله

) رشد

ATCC 8014
شکل .۱ اثرفعالیت ضدمیکروبی سوپرناتانت سویه ل. پلانتاروم ATCC8014 بر باکتری سالمونلا انتریکا

۳