مقدمه

نیتریک اکساید براي اولین بار در سال ۱۹۸۷به عنوان یک که به نیتریک اکساید فعال ویژه (RNOS) شهرت دارد.
فاکتور شل کننده در عروق کشف شد .(۱۳) این ماده RNOS نوع ویژه اي از نیتریک اکساید است که از اکسید
چربی دوست است و قابلیت انتشار بالایی براي عبور از شدن نیتریک اکساید توسط سوپر اکسید تولید می شود و
عرض غشاء دارد، فعالیت آن به نوع سلول هدف و تراکم باعث ایجاد رادیکالهاي آزاد نیتریک اکساید می گردد. این
آن بستگی دارد .(۱۸) نیتریک اکساید داراي نیمه عمر مواد میل ترکیبی بالایی براي پروتئینها و نوکلوتیدها دارند
کوتاهی است که بین۴۵-۱۵ ثانیه است(.(۲۰ این ماده به که شامل نیتروژن دي اکساید، نیتروژن تري اکساید، دي
تنهایی قادر به ایجاد واکنش با پروتئینها و نوکلوتید ها نمی نیتروژن تري اکساید و دي نیتروژن تترا اکساید می باشند.
باشد ولی در حضور سوپر اکساید واکنش پذیر می گردد،

۱۴۴

NO3-
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

واکنش شیمیایی تولید RNOS به صورت زیر می باشد

.(۲۱)

Nitrogen dioxide 2NO + O2→۲NO2
Nitrogen trioxide NO2 +1/2O2→NO3
Dinitrogen trioxide NO2+NO→N2O3
Dinitrogen tetraoxide NO2+ NO2→N2O4

RNOS می تواند با بار مثبت یونهاي فلزي موجود در کمپلکس آنزیمها واکنش دهد، مانند واکنش نیتریک اکساید با آهن موجود در هموگلوبین که باعث تولید آنیون NO3 و

مت هموگلوبین می گردد. ترکیب یون با آهن

موجود در گوانیل سیکلاز باعث تولید کمپلکس آهن-

نیتروزیل و غیر فعال شدن گوانیل سیکلاز می گردد. آنیون

NO3 می تواند باعث القاي آسیب به DNA، پراکسیداسیون لیپیدها و شکستن پروتئینها گردد .(۵)

نیتریک اکساید از ال- آرژنین ساخته می شود. براي انجام این واکنش NADPH، FAD، BH4 و اکسیژن لازم است.

محصولات ابن واکنش نیتریک اکساید و سیترولین می باشند. کاتالیز این واکنش توسط آنزیم نیتریک اکساید سنتتاز صورت می گیرد ۱۵) و .(۱۶
ایزوفرمهاي مختلفی ازآنزیم نیتریک اکساید سنتتاز (NOS)

وجود دارد که دریک دامنه وسیع از شرایط فیزیولوژیک و پاتولوژیک فعال می گردند. این ایزوفرمها در دوگروه کلی قرار می گیرند.

-۱ ایزوفرمهاي وابسته به کلسیم: این ایزوفرمها مقدار نیتریک اکساید کمتري نسبت به گروه دیگر تولید می کنند که مقدار آن در حد نانومولار است. این ایزوفرمها شامل دو گروه می باشند که عبارتند از:

– نیتریک اکساید سنتتاز اندوتلیوم رگی((eNOS که در گشاد کردن رگها مؤثر است(.(۳
– نیتریک اکساید سنتتاز عصبی((nNOS که در سلول عصبی فعال می باشد و در پلاستیسته نورونی دخالت دارد(.(۱۴

جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳

-۲ ایزوفرم غیر وابسته به کلسیم: در این ایزوفرم مقدار تولید نیتریک اکساید در حد میکرومولار است که شامل یگ گروه می باشد.

– نیتریک اکساید سنتتاز القایی (iNOS) که ابتدا در سلولهاي ایمنی کشف شد و اینتر لوکین ها و TNF-α
می توانند آن را فعال کنند(.(۲۲

لازم به ذکر است که، نقش نیتریک اکساید در سلولهاي سرطانی به خوبی شناخته نشده است و اثر این ماده به نوع سلول و مقدار تراکم آن بستگی دارد. تحقیقات نشان داده است که، نیتریک اکساید در بعضی از سلولها نقش آپوپتوزي (۸) و در بعضی دیگر نقش ضد آپوپتوزي دارد.

به عنوان مثال، اضافه کردن دهنده هاي نیتریک اکساید به سلولهاي مونوسیت U937 باعث جلوگیري از روند آپوپتوز در این سلولها می شود .(۱۲) در ضمن، در سلولهاي سرطان سینه انسان MCF-7 تراکم پایین از یک دهنده نیتریک اکساید مانند سدیم نیترو پروساید (SNP) باعث مهار آپوپتوز می شود در حالی که، تراکم بالاي آن قادر به القاي آپوپتوز در این سلولها می باشد .(۷) علاوه بر این، در سلولهاي ماکروفاژي Raw-264، دهنده هاي نیتریک اکساید مانند نیتروگلوتامین و SNP باعث القاي بیان پروتئین p53 و افزایش بروز آپوپتوز در این سلول می گردند .(۶)

در تحقیق حاضر از دودمان سلول توموري هیپوفیز موش

GH3/B6 استفاده شد که قابلیت سنتز و ترشح هورمون رشد و پرولاکتین را دار می باشد .(۱۰) در ضمن، این دودمان سلولی ایزوفرمهاي iNOS و nNOS را نیز بیان می کند .(۱۹)

مواد و روشها

– کشت سلول:GH3/B6 سلولهاي GH3/B6 در محیط کشت (GIBCO) HamsF12 به همراه ۱۲/۵ درصد سرم اسب (HIMEDIA) و ۲/۵ درصد سرم جنین گوساله

۱۴۵

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳

(GIBCO) غیر فعال شده کشت داده شد. شرایط اتمسفري مناسب براي رشد این سلولها رطوبت ۹۵ درصد، دماي ۳۷

درجه سانتی گراد و ۵ درصد دي اکسید کربن می باشد.

این سلولها به صورت تک لایه به سطح فلاسک چسبیده و تکثیر می شوند ۱) و.(۲

– بررسی درصد مهار تکثیر سلول: براي به دست آوردن درصد مهار تکثیر سلول از روش MTT استفاده شد. ۲۰۰در هر چاهک پلیت ۹۶ خانه اي تعداد ۱۰۴ سلول کشت داده شد. سلولها پس از ۷۲ ساعت پیش انکوباسیون، با غلظتهاي مختلف (FLUKA) AP ، MCP

(EcoNugenics) و(MERCK ) SNP تیمار شد. سپس پلیتها براي مدت زمانهاي ۶، ۲۴ و ۴۸ ساعت در انکوباتور

– سنجش نیتریک اکساید: براي سنجش نیتریک اکساید از واکنشگر گریس استفاده شد. بدین منظور تعداد ۱۰۵ سلول در هر چاهک مولتی دیشهاي ۲۴ خانه اي کشت داده شد.
پس از ۷۰ ساعت پیش انکوباسیون، سلولها با غلظتهاي مختلف AP ، MCP و SNP تیمار شدند. پلیتها براي زمانهاي ۲، ۴، ۶، ۲۴ و ۴۸ ساعت در انکوباتور قرار گرفتند. پس از طی زمان مورد نظر ۵۰µl از محیط رویی سلول را برداشته و به آن ۵۰µl محلول سولفانیل آمید

آنالیز آماري: آنالیزهاي آماري با استفاده از نرم افزار SPSS 15 و تست پارامتریک ANOVA یک طرفه انجام شده

قرار گرفتند. پس از طی زمان مورد نظر به هر چاهک ۲۰μl

از محلول (SIGMA) MTT با غلظت ۵mg/ml اضافه شد و در دماي ۳۷ درجه سانتی گراد براي مدت ۳ ساعت انکوبه گردید. سپس پلیت حاوي سلولها از انکوباتور خارج شده و محیط روي سلولها تخلیه و به چاهکهاي مورد نظر (SIGMA)DMSO 200μl اضافه گردید. سپس میزان جذب با دستگاه microplate Reader در طول موج ۶۳۰nm مورد بررسی قرار گرفت. براي به دست آوردن مهار تکثیر سلول از فرمول زیر استفاده گردید .(۱۸) بر این اساس مهار تکثیر سلولها در زمانهاي مختلف و غلظتهاي مختلف ماده مورد نظر به دست آمد.

(MERCK) اضافه گردید و سپس ۵۰µl محلول NED

(Naphthylethyl-enediamindihydrochloride) (MERCK) نیز به همه چاهکها اضافه گردید. جذب با دستگاه microplate Reader در طول موج ۵۷۰nm خوانده شد. میزان جذب در این طول با مقدار آزاد سازي نیتریک اکساید رابطه مستقیم دارد(.(۱۱ میزان ترشح نیتریک اکساید براي هر غلظت از مواد مورد استفاده جهت تیمار از رابطه زیر استفاده شد:

است. ≤P 0/05 به عنوان اختلاف معنی دار محاسبه گردید.

نتایج به صورت ±SEM میانگین (n =3) نشان داده شد.

۱۴۶

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳

شکل -۱ تغییرات مورفولوژیکی سلولها پس از تیمار با ۵ mg/ml اسید پکتیک در زمان انکوباسیون۴۸ ساعت. در تصویر سمت راست کاهش حجم سلول و گرانوله شدن سلولها نشان داده شده است تصویر سمت چپ گروه کنترل می باشد.

شکل -۲ تغییرات مورفولوژیکی سلولها پس از تیمار با MCP 5 mg/ml در زمان انکوباسیون۴۸ ساعت. در تصویر سمت راست کاهش حجم سلول و گرانوله شدن سلولها نشان داده شده است تصویر سمت چپ گروه کنترل می باشد.

شکل -۳ تغییرات مورفولوژیکی سلولها پس از تیمار با SNP10mM در زمان انکوباسیون۴۸ ساعت. در تصویر سمت راست کاهش حجم سلول و گرانوله شدن سلولها نشان داده شده است تصویر سمت چپ گروه کنترل می باشد.

۱۴۷

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

نتایج

– اثر AP ، MCP و SNP بر مورفولوژي سلولهاي

: GH3/B6 به منظور مطالعه اثر AP، MCP و SNP بر

مورفولوژي سلولهاي GH3/B6، تعداد ۱۰۴ سلول در هر چاهک پلیت ۹۶ خانه اي کشت داده شد. مدت پیش انکوباسیون ۷۲ ساعت در نظر گرفته شد. سپس غلظتهاي مختلف از AP (شکل(۱، MCP (شکل(۲ ،SNP (شکل(۳

در زمان ۴۸ ساعت روي سلولها اثر داده شد. این سلولها به وسیله میکروسکوپ اینورت مورد بررسی و عکسبرداري قرار گرفتند.

تغییرات مورفولوژیکی سلولهاي GH3/B6 پس از سپري شدن ۴۸ ساعت به ترتیب زیر می باشد
-۱ گروه سلولهایی که نمونه کنترل می باشند در آنها تغییري از این نظر ایجاد نشده است.

-۲ در سلولهاي تیمار شده با دوز بالا AP، MCP و SNP

تغییراتی نظیر چروکیده شدن غشاء، کاهش حجم سلول وگرانوله شدن آن مشاهده گردید. ضمنا تعدادي از سلولها از کف فلاسک جدا شده وشناور گردیدند.

-بررسی درصد مهار تکثیر سلولهاي GH3/B6 به وسیله

تست AP : MTT وMCP در زمان ۶ ساعت تیمار تأثیر

محسوسی بر درصد مهار تکثیر سلولهاي GH3/B6

جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳

نداشت، اما APدر زمان ۲۴ و ۴۸ ساعت در غلظتهاي ۵ mg/ml و ۲/۵ باعث افزایش معنی دار درصد مهار تکثیر سلولها نسبت به گروه کنترل گردید ( p<0.001) (شکل.(۴
همچنین MCP در زمان ۲۴ و ۴۸ ساعت با غلظتهاي ۵ mg/ml و ۳ باعث افزایش معنی دار مهار تکثیر سلولهاي GH3/B6 نسبت به گروه کنترل می شود.
( p<0.001) (شکل.(۵

SNP با غلظتهاي ۲۰ mM و ۱۰، ۵ پس از ۶ ساعت انکوباسیون باعث افزایش معنی دار مهار تکثیر سلولهاي

GH3/B6 نسبت به گروه کنترل شد .(p<0.001) این ماده در زمانهاي ۲۴ و ۴۸ با غلظتهاي۲۰ mM و ۱۰، ۵، ۱

افزایش معنی دار مهار تکثیر سلولهاي GH3/B6 نسبت به گروه کنترل را نشان داد (p<0.001) (شکل.(۶

بنابراین می توان این گونه نتیجه گرفت که، درصد مهار تکثیر سلولهاي GH3/B6 تحت تأثیر AP، MCP و SNP

در یک حالت وابسته به دوز و زمان، افزایش نشان می دهد. در ضمن مهار تکثیر سلولهاي GH3/B6 که تحت انکوباسیون ۴۸ ساعت قرار گرفته اند افزایش معنی داري نسبت به مهار تکثیرسلول در انکوباسیون ۲۴ ساعت نشان

داد .( p<0.001)

شکل -۴ اثر غلظتهاي متفاوت اسید پکتیک بر درصدمهار تکثیرسلولهاي GH3/B6 پس از۶و۲۴و۴۸ساعت انکوباسیون. غلظتهاي ۲/۵mg/ml و۵ AP باعث افزایش معنی دار مهار تکثیر سلولهاي تحت تیمار نسبت به گروه کنترل شده است. مقادیر ارائه شده معادل mean±S.E.M می باشند.

a = p<0.001)، و (N=3

۱۴۸

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳

شکل-۵ اثر غلظتهاي متفاوت پکتین تغییر شکل یافته مرکبات بر درصد مهار تکثیر سلولهاي GH3/B6پس از ۶، ۲۴ و۴۸ساعت انکوباسیون. غلظتهاي ۱/۵mg/mlو۳وMCP5باعث افزایش معنی دار مهار تکثیر سلولهاي تحت تیمار نسبت به گروه کنترل شده است. مقادیر ارائه شده معادل

mean±S.E.M می باشند. a = p<0.001)، و (N=3

شکل-۶ اثر غلظتهاي متفاوت سدیم نیتروپروساید بر درصد مهار تکثیر سلولهاي GH3/B6 پس از ۶، ۲۴ و۴۸ ساعت انکوباسیون. غلظتهاي ۲۰ ،۱۰

،۵ ،۱، ۰/۵میلی مولار سدیم نیتروپروساید تفاوت معنی داري در افزایش مهار تکثیر سلولهاي تیمار شده نسبت به کنترل ایجاد کرده است. مقادیر ارائه شده معادل mean±S.E.Mمی باشند. a = p<0.001)، b = p<0 .01، c = p<0. 05 و (n=3