مقدمه

آنژیوژنزیس یا رگزایی فرآیند فیزیولوژیک شرکت کننده در بهبود زخم، رشد و تکوین جنین، زایمان و تکثیر آندومتر میباشد. رگزایی همچنین فرآیند اساسی در تکثیر، گسترش و متاستاز سلولهاي سرطانی است ۲) و.(۱۳ زمانی که اندازه تومور کمتر از ۰/۵mm است، مواد غذایی و اکسیژن مورد نیاز سلولهاي سرطانی از طریق انتشار تأمین می شود

(avascular stage)، اما هنگامی که اندازه تومور بیش از ۰/۵mm باشد، مواد غذایی و اکسیژن حاصل از انتشار به

اندازه کافی به سلولها نخواهد رسید و در این زمان سلولهاي سرطانی شروع به تولید فاکتورهاي رگزایی از جمله VEGF، FGF2 و PDGF می کنند ( vascular 2) (stageو.(۳ تومور تا زمانی که بتواند با ترشح فاکتورهاي رگزا باعث رشد رگهاي جدید شود، درمرحله کمون می ماند. فرآیند رگزایی شامل مراحل ترشح فاکتور رگزا ، قرار گیري آن روي گیرنده، تخریب غشاءي اولیه و

۴۲۶

Gal -3
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

مهاجرت سلولهاي اندوتلیالی به سوي تومور می باشد ۷) و .(۱۳

یکی از مواد اصلی تشکیل دهنده دیواره سلولی در سلولهاي گیاهی پکتینها می باشند که در میان پلی ساکاریدها بیشترین پیچیدگی ساختاري را دارا هستند .
پکتین مرکبات اغلب در گوشت و پوست مرکباتی مثل گریپ فروت ، پرتقال و لیمو یافت می شود. این ماده، پلی ساکارید بسیار منشعب و پیچیده به همراه تعداد زیادي زیر واحدهاي گالاکتوزید است و به وسیله تغییر pH یا دما می توان آن را به صورت پکتین تغییر یافته در آورد .(۱۲)

تحقیقات نشان داده است که، MCP باعث القاي آپوپتوز در سلولهاي سرطانی شده و از مهاجرت آنها جلوگیري می کند. بنابراین مانع بروز متاستاز می گردد .(۴) در سلولهاي سرطانی، Gal -3 باعث اتصال سلولها به اندوتلیوم رگهاي

خونی میگردد، بنابراین میتواند در متاستاز

سلولهاي سرطانی نقش مهمی ایفا کند(MCP .(1 در سطح سلولهاي سرطانی به Gal-3 متصل و مانع از اتصال آن به سایر گیرنده هاي سطح سلولی (که بر روي سلولهاي دیگر مستقر می باشند) میشود. مطالعات نشان می دهند که گیرنده Gal- 3 عامل القاي حرکت و مهاجرت سلولهاي اندوتلیال بر روي ماتریژل و ایجاد شبکه هاي شبه مویرگی دراین سلولها به صورت in vitro می باشد . MCP با مهار

Gal-3، مانع مهاجرت سلولهاي اندوتلیال و شکل گیري شبکه هاي شبه مویرگی می گردد. در مدلهاي سرطانی، تغذیه با MCP سبب مهار رگزایی و مهار متاستاز میشود
.(۴)

در پژوهش حاضر اثر پکتین تغییر یافته مرکبات در سلولهاي سرطانی پروستات DU145 در موارد زیر مورد بررسی قرار گرفته است:

• بررسی اثر پکتین مرکبات تغییر یافته بر درصد زیستایی سلولهاي سرطانی DU145 و سلولهاي آندوتلیالی

HUVEC

جلد ۲۶، شماره ۴، ۱۳۹۲

• بررسی اثر MCP در میزان رگزایی سلولهاي HUVEC

• بررسی اثر این ماده روي مهاجرت سلولهاي HUVEC

در این مطالعه نشان داده شده است که به کاربردن MCP

روي دودمان سلولهاي سرطان پروستات DU145 می تواند مهاجرت آنها را مهار کند و از متاستازي شدن آنها جلوگیري نماید. بنابراین شاید بتوان با دسترسی به داروهاي غیرشیمیایی مؤثر در مهار متاستاز، با توجه به کم بودن اثرات جانبی این مواد، از آنها در از بین بردن این سلولها استفاده کرد و میزان مصرف داروهاي شیمیایی را کاهش داد.

مواد و روشها

کشت سلول: در اینجا، به منظور رشد و تکثیر سلولهاي

DU145 از محیط RPMI 1640 ، که به آن ۱۰ درصد سرم جنین گاو اضافه شده بود، استفاده گردید. کشت سلولهاي

HUVEC در محیط DMEM/HamsF12 حاوي ۲۰ درصد سرم جنین گاو صورت گرفت. براي سترون کردن محیط و جلوگیري از آلودگی، پنی سیلین با غلظت ۱۰۰ UI/ml و
استرپتومایسین با غلظت ۱۰۰ μg/ml به محیط اضافه و pH

مناسب براي آن بین ۷-۷/۲ تنظیم گردید.

آماده سازي پکتین تغییریافته مرکبات: تهیه پکتین تغییر یافته با توجه به روش انجام شده توسط آوراهام راز صورت گرفت. براي این منظور محلول ۱/۵ درصد پکتین تهیه گردید، سپس pH محلول حاصل توسط ۳ NaOH

نرمال به ۱۰ رسانده شد و پس از یک ساعت انکوباسیون در دماي ۵۵ درجه سانتی گراد، توسط محلول HCL، روي

۳ pH تنظیم گردید. محلول حاصل به مدت یک شبانه روز در دماي محیط نگهداري و سپس به آن اتانل اضافه گردید.

محلول ژلاتینی حاصل در نهایت پس از عبور از کاغذ صافی، خشک و به عنوان MCP مورد استفاده قرار گرفت

.(۱۰)

۴۲۷

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۴، ۱۳۹۲

تعیین درصد زیستایی: به منظور تعیین درصد زیستایی سلولها از روش تریپان بلو استفاده شد. ابتدا تعداد ۲×۱۰۵

سلول در ظروف ۲۴ چاهکی کشت داده شد و بعد از ۲۴

ساعت پیش انکوباسیون، سلولهاي DU145 و HUVEC با غلظتهاي مختلف ۱ g/ml) MCP، ۰/۵، ۰/۱، ۰/۰۵، (۰/۰۱

تیمار شدند. در مورد سلولهاي HUVEC علاوه بر MCP

از (Phenethyl Isothiocyanate) PEITC (با غلظت

۶/۸ mM و (۳/۴ به عنوان کنترل منفی و ng/ml) VEGF

۴۰ ، ۳۰ و ( ۱۵ به عنوان کنترل مثبت استفاده شده است

۱۴) و .(۱۵ پس از طی دوره هاي زمانی ۲۴ و ۴۸ ساعت انکوباسیون سلولها توسط تریپان بلو ۴ درصد ، رنگ آمیزي و درصد سلولهاي زنده به وسیله میکروسکوپ نوري تعیین گردید.

کشت سه بعدي سلولهاي :HUVEC به منظور کشت سه بعدي سلولهاي HUVEC از کلاژل (ژل کلاژن) استفاده شد. براي تهیه این ژل ابتدا کلاژن نوع (Sigma) I در اسید استیک ۰/۱ مولار محلول و پس از افزودن ۱۰۰ µlمحیط کشت ۱۰X، pH آن توسط NaOH نرمال روي ۷ تنظیم گردید. محلول حاصل در ظروف کشت ۹۶ چاهکی ریخته و به منظور ایجاد ژل به مدت ۳۰- ۲۰ دقیقه در دماي ۳۷
درجه سانتی گراد نگهداري شد.

بعد از آماده شدن کلاژل ، تعداد۱×۱۰۴ سلول در هر چاهک براي ۴۸ ساعت کشت داده شد. در این مدت کم کم شبکه هاي شبه مویرگی شروع به ظاهر شدن می کنند.

سپس محیط رویی سلولهاي DU145 که از قبل به مدت

۲۴ ساعت با غلظتهاي مختلف MCP تیمار شده بود، با محیط رویی سلولهاي HUVEC جابه جا گردید و شکل گیري شبکههاي شبه مویرگی طی مدت زمان ۴۸ ساعت، توسط میکروسکوپ فاز معکوس مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی مهاجرت سلولهاي :HUVEC تعداد ۵×۱۰۵ سلول در ظروف کشت ۲۴ چاهکی کشت داده شد، سپس با کمک چاقوي جراحی به کف هر چاهک خراشی داده شد

و سلولها با تراکمهاي مختلف MCP مورد تیمار قرار گرفتند. مهاجرت سلولهاي HUVEC به منظور پر کردن خراش به مدت ۴۸ ساعت ، توسط میکروسکوپ فاز معکوس دنبال شد.
تجزیه و تحلیل آماري: تجزیه و تحلیل هاي آماري با استفاده از نرم افزار SPSS و تست پارامتریک ANOVA

یک طرفه و دو طرفه انجام شد. نتایج به صورت ±SEM

میانگین (n =3) نشان داده شده است.

نتایج

اثر MCP بر ریختشناسی سلولی: ریخت شناسی سلولهاي DU145 پس از ۴۸ ساعت در نمونه شاهد به صورت تک لایه، چسبیده به کف فلاسک و در حال تقسیم مشاهده می شوند. در نمونه هاي با غلظت پایینMCP

۰/۰۱) و (۰/۰۵ g/ml تغییري در ریخت شناسی سلولها نسبت به سلولهاي شاهد مشاهده نشد. اما در نمونه هایی که با غلظتهاي بالاي ۰/۱) MCP، ۰/۵، و (۱ g/ml تیمار شده بودند، تغییرات قابل ملاحظه اي در شکل آنها دیده شد (شکل :(۱

• تغییرات عمده در حالت طبیعی غشاءي سلولی و گرانوله شدن سلولها
• کاهش حجم سلول

در مورد سلولهاي HUVEC ، پس از ۲۴ و ۴۸ ساعت انکوباسیون، سلولهاي گروه کنترل به صورت تک لایه به ته ظرف می چسبند ( شکل .( ۲ -a در انکوباسیون ۴۸ ساعت و در غلظتهاي پایین ۰/۰۱) MCP، ۰/۰۵ و (۰/۱ g/ml

تغییري در شکل آنها نسبت به سلولهاي شاهد مشاهده نگردید. در حالی که غلظتهاي بالاي ۰/۵) MCP، و g/ml

(۱ تغییر در شکل سلولها شامل چروکیده شدن غشاء، گرانوله شدن سیتوپلاسم و جدا شدن سلولها از کف فلاسک می باشد (شکل.(۲

۴۲۸

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۴، ۱۳۹۲

شکل – ۱ مورفولوژي سلولهاي DU145 پس از ۴۸ ساعت تیمار با غلظتهاي مختلف – (mg/ml )MCP با افزایش غلظت MCP سلولها چروکیده شده و در سیتوپلاسم آنها گرانولهایی مشاهده میشود.

اثر MCP بر درصد زیستایی سلول: در زمانهاي ۲۴

ساعت و ۴۸ ساعت غلظتهاي ۰/۰۵، ۰/۱ ،۰/۵، ۱ g/ml

MCP کاهش معنی دار درصد زیستایی سلولهاي DU145

نسبت به گروه کنترل مشاهده گردید (نماد *** براي

p< 0/001 و نماد ** براي .(p0/01 بررسی آماري توسط آزمون ANOVA دو طرفه می باشد. کاهش درصد

زیستایی سلولهاي DU145 وابسته به دز (p<0/001) و

وابسته به زمان (p<0/001) است، اما اختلاف معنی دار بین دو زمان ۲۴ و ۴۸ ساعت انکوباسیون دیده نشد. بنابراین می توان نتیجه گیري کرد که، MCP در حالت وابسته به دز و در زمان ۲۴ ساعت سبب کاهش بقاي سلولهاي DU145

می گردد (شکل.(۳