مقدمه

آلودگیهاي خاك توسط فلزات سنگین و مواد آلی می تواند نفت خام در خاك می تواند سبب تأخیر در جوانه زنی،
سبب تغییر خواص فیزیکو شیمیایی خاك شود. در کاهش تعداد جوانه ها، تأثیر در رشد گیاه شود ۱۱) و .(۱۵
کشورهاي تولید کننده نفت، آلودگی خاك توسط نفت خام برخی از گیاهان قادرند غلظتهاي بالاي نفت را در خاك
می تواند در حین حمل، پالایش و استخراج رخ بدهد. تحمل کرده و رشد کنند. این گیاهان معمولاً جهت گیاه
نفت می تواند از خاك به آبهاي سطحی و زیر سطحی نفوذ درمانی خاك آلوده به نفت خام استفاده می شوند ۵)، ۶ و
کرده و وارد زمینهاي کشاورزي شده و سبب آسیب به .(۱۰ گونه هاي گرامینه و بقولات جزء گیاهانی هستند که
گیاهان زراعی و موجودات خاك شود. مطالعات زیادي در توانایی خوبی در گیاه پالایی خاك دارند ۴)، ۸ و (۱۲،
رابطه با تأثیر نفت بر روي گیاهان انجام شده است. حضور گرامینه ها داراي ریشه افشان بوده که به خوبی در خاك
۳۸۶

One Way ANOVA
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

نفوذ کرده و آلودگی خاك را کاهش می دهند (۴) از طرف دیگر بقولات به خاطر قابلیت تثبیت نیتروژن خاك، گونه هاي مناسبی براي گیاه پالایی می باشند .(۷) در این گیاهان رقابتی بین گیاه با جمعیت میکروبی براي به دست آوردن نیتروژن خاك صورت نگرفته که نتیجه آن همکاري مناسبی بین باکتریها و گیاه در جهت حذف و کاهش آلودگی نفتی خاك است .(۷) با آنکه مطالعات زیادي در مورد تأثیر نفت بر روي گیاهان مختلف صورت گرفته ولی تاکنون گزارشات اندکی از تأثیر آلودگی نفتی بر روي فعالیت آنزیمهاي گیاهی اعلام شده است(.(۳ در این مطالعه از گیاه عدس که جزء بقولات است استفاده شد و تأثیر نفت بر رشد گیاه و تأثیر آن بر فعالیت آلکالن فسفاتاز گیاه مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

آلوده سازي خاك به نفت خام: نفت خام سبک از ناحیه سرکان در غرب ایران تهیه شد. نفت با غلظتهاي ۱، ۳ و ۵
در صد به خاك اضافه و به خوبی مخلوط گشت تا کاملاً یکنواخت شود . (۱۲ ) سپس خاك به گلدانهاي ۱ کیلویی انتقال داده شد. از هر غلظت ۵ تکرار آماده کشت و ۵
نمونه نیز بدون آلودگی و به عنوان شاهد تهیه شد. در هر گلدان تعداد ۱۰ دانه عدس کاشته شد و مقدار ۰/۵ گرم کود حیوانی نیز به گلدانها اضافه شد. سپس آب لازم (در حدود ۷۵ درصد ظرفیت زراعی) براي رشد گیاه به گلدانها داده شد.

بررسی رشد گیاه: پس از ۱۵ روز از کشت گیاه، تعداد جوانه ها در هر گلدان شمارش شد. طول ساقه گیاه پس از یک ماه اندازه گیري شد سپس گیاه از خاك خارج شده و مقدار زیست توده ریشه و ساقه آن وزن گردید. با توجه به تأثیر غلظت ۵ درصد آلودگی نفتی بر روي گیاه، نمونه هاي

%۵ براي مقایسه فعالیت آنزیمی ریشه و ساقه با شاهد انتخاب شد. ریشه و اندام هوایی نمونه هاي ۵ درصد و

شاهد در دماي -۲۰ درجه براي تعیین فعالیت آنزیمی

نگهداري شد.

تعیین فعالیت و بررسی کینتیکی آنزیم آلکالن فسفاتاز:

ریشه و ساقه گیاه پس از خروج از دماي -۲۰ درجه توسط هموژنایزر شکسته شد و سپس در دور ۵۰۰۰ x g و به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ گردید. رسوب که شامل سلولهاي شکسته نشده بود از مایع رویی جدا شد و سوپرناتنت به عنوان سوپ فاقد سلول براي فعالیت آنزیمی استفاده شد.

جهت تعیین فعالیت آنزیم مقدار ۰/۱ میلی لیتر از سوپ سلولی به ۲/۸ میلی لیتر بافر ۰/۱ مولار تریس با ۸/۵ pH

اضافه شد و سپس مقدار ۰/۱ میلی لیتر نیز محلول پارا نیترو فنیل فسفات (pNPP) به عنوان سوبستراي آنزیم اضافه شد و تغییرات جذب تولید محصول واکنش یعنی پارا نیتروفنل در طول موج ۴۱۰ نانومتر ثبت گردید. جهت محاسبات کینتیکی سوبسترا با غلظتهاي مختلف ۳,۵) تا ۱۸

میلی مولار) به محلول آنزیم و بافر اضافه شد و جذب در زمانهاي ۱، ۳، ۵، ۷، ۱۰و ۱۵ دقیقه ثبت شد. از اعداد به دست آمده منحنی عکس غلظت بر علیه عکس سرعت
(Lineweaver- plot) رسم و سرعت ماکزیمم (Vmax) و Km آنزیم محاسبه شد.
فعالیت آنزیم نیز با توجه به اینکه ضریب خاموشی

(Extinction coefficient) پارانیترو فنل مقدار ۱۸/۸ * ۱۰۳

لیتر بر مول است محاسبه شد.

آنالیز آماري: داده هاي به دست آمده به صورت میانگین –

انحراف معیار (SD) در نظر گرفته شد. براي تعیین اختلاف

معنی دار نتایج از آنالیز واریانس و

تست مکمل Tukey استفاده شد و مقدار P کمتر از ۵

درصد (p< 0 .05) معنی دار مشخص شد.

۳۸۷

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

نتایج

شمارش تعداد جوانه ها در گیاه: شمارش تعداد جوانه ها در نمونه ها نشان داد که حضور نفت خام در گیاه تأثیري در جوانه زدن گیاه نداشته است به طوري که حتی در نمونه ۵ درصد هیچ گونه تفاوت معنی داري با نمونه کنترل دیده نشد (شکل .(۱ با این حال حضور نفت سبب تأخیر در جوانه زدن شد.

شکل- ۱ شمارش تعداد جوانه ها در خاك . هیچگونه اختلاف معنی داري بین نمونه هاي آلوده و شاهد دیده نشد.

شکل-۲ اندازه گیري طول اندام هوایی در گیاه. در نمونه ۵ درصد کوتاه ترین اندام هوایی دیده شد.

بیشترین مقدار زیست توده در نمونه شاهد (فاقد نفت) و

کمترین آن در نمونه ۵ درصد مشاهده شد (شکل.(۳

اختلاف معنی داري بین نمونه کنترل و ۵ درصد دیده شد.

نفت نه تنها بر روي ساقه و اندام هوایی بلکه بر روي میزان رشد ریشه نیز مؤثر بود. اندازه گیري مقدار زیست توده ریشه در نمونه ها نشان داد که کمترین مقدار زیست توده گیاه در نمونه ۵ درصد و بیشترین آن در نمونه کنترل مشاهده شد(شکل.(۳ مشاهده ماکروسکوپی ریشه نشان داد هر چه بر غلظت نفت در خاك افزوده شود از پراکندگی ریشه در خاك کاسته شده و مقدار انشعابات ریشه نیز کم می شود. حضور نفت در خاك سبب تأخیر در جوانه زنی و تأثیر بر روي رشد گیاه شد. به طوري که هر چه بر مقدار نفت در خاك افزوده شد از طول ساقه گیاه کاسته شد. همچنین حضور نفت باعث زردي زودرس برگهاي گیاه شد.

بررسی فعالیت آلکالن فسفاتاز در ریشه: با توجه به تغییرات ماکروسکوپی که در نمونه ۵ درصد نسب به شاهد مشاهده شد، براي مطالعه تغییرات آنزیمی از نمونه هاي ریشه و ساقه در خاك آلوده به نفت با غلظت ۵ درصد استفاده و با شاهد (خاك بدون نفت) مقایسه شد. بررسی فعالیت آلکالن فسفاتاز ریشه گیاه در حالت آلوده و شاهد نشان داد که هر دو فاکتور Km و Vmax آنزیم در نمونه آلوده نسبت به شاهد تفاوت کرده است به طوري که هم Km و هم Vmax افزایش را نشان داد (شکل .(۴

بررسی اندازه و طول اندام هوایی گیاه نشان داد که در نمونه ۵ درصد از طول اندام هوایی کاسته شده ولی تفاوت معنی داري بین کنترل و نمونه هاي آلوده به نفت مشاهده نشد. به غیر از نمونه ۵ درصد، حضور آلودگی تأثیري بر رشد و طول اندام هوایی گیاه نداشت (شکل.(۲
اندازه گیري زیست توده گیاه: بررسی مقدار زیست توده کل(ریشه و ساقه) نشان داد که هر چه غلظت نفت در نمونه بیشتر باشد از مقدار زیست توده کل کاسته می شود.

بررسی فعالیت آلکالن فسفاتاز در اندام هوایی : مقایسه فعالیت آنزیم آلکالن فسفاتاز در ساقه گیاه آلوده و شاهد نشان داد که فاکتور Km در نمونه آلوده افزایش یافته و Vmax نیز افزایش نشان داده است. مقایسه Km نمونه آلوده و شاهد اختلاف معنی داري بین آنها نشان نداد

(شکل.(۵

مقایسه فعالیت ویژه آنزیم در ریشه و ساقه: محاسبه فعالت ویژه آنزیم آلکالن فسفاتاز در ریشه گیاه شاهد و

۳۸۸

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

آلوده نشان داد که فعالت ویژه در ریشه گیاه شاهد در حدود ۱۰ ± ۲ U/mg protein و در نمونه آلوده در حدود U/mg protein ٢/١۵/۹± بوده ا ست در حالی که در ساقه گیاه فعالیت ویژه براي شاهد در حدود U/mg 4/65 ± ۰/۹ protein و براي نمونه آلوده در حدود

U/mg protein ٨/٠۴/۲۵± محاسبه گشت. اختلاف معنی داري بین فعالیت ویژه آنزیم در ریشه گیاه شاهد و آلوده مشاهده می شود که این اختلاف در اندام هوایی گیاه به چشم نمی خورد.