مقدمه

فلور میکروبی روده نقش کلیدي در سلامتی و تغذیه میزبان بازي میکند (Burr et al., 2005) و محیط پیرامون موجودات نقش مهمی در شکلگیري این فلور دارد (Hansen & .Olafsen, 1999) در سالهاي اخیر تحقیقاتی درباب تغییر این فلور درجهت افزایش میزان باکتريهاي مفید و همچنین متابولیتهاي آنها از طریق کاربرد پروبیوتیکها و پریبیوتیکها صورتگرفته است. پروبیوتیکها میکروارگانیزمهاي مفید مانند باکتريهاي لاکتیک اسید و گونههاي مختلف باسیلوسها هستند که می توانند ازراه جیرههاي غذایی وارد سیستم گوارش میزبان شوند و علاوه بر تحریک رشد ازطریق سازوکارهاي مختلف، در رقابت با باکتريهاي بیماريزا باعث بهبود سیستم ایمنی میزبان شوند؛ درحالیکه پریبیوتیکها ترکیباتی هضم-نشدنیهستند که صرفاً بهوسیله میکروارگانیسمهاي خاصی در انتهاي روده تجزیه و باعث افزایش سلامتی و رشد موجود می

شوند (Gibson & Roberfroid, 1995; Manning &

.Gibson, 2004) تأثیر مثبت پریبیوتیکها بر تحریک سیستم ایمنی، تولید متابولیتهاي مفید در روده ازطریق تغییر فلور میکروبی، افزایش جذب عناصر و تحریک رشد در انسان (Manning & Gibson, 2004)، حیوانات اهلی

(Smiricky-Tjardes et al ., 2003; Patterson & Burkholder, 2003) و ماهیان گزارش شده است-(Grisdal

Helland et al., 2008; Akrami & Hajimoradloo, .2009; Yousefian & Amiri, 2009) در اثر تخمیر پریبیوتیکها اسیدهاي چرب کوتاهزنجیره تشکیل میشوند که با اسیديکردن محیط روده تغییراتی در فلور میکروبی روده ایجاد میکنند. براي مثال گزارشهایی دربارة تأثیر بازدارنده اسیدهاي چرب کوتاه زنجیره بر روي Salmonella spp. و

Vibrio spp. وجود دارد .(Defroidt et al., 2007) روش-

هاي مختلفی براي شناسایی باکتريها و بررسی تنوع ساختاري آنها در اکوسیستمها پیشنهاد شده است که در این میان میتوان به روشهاي وابسته به محیط هاي کشت میکروبی و روشهاي مولکولی، مانند تکثیر ناحیه ژنی SrRNA با استفاده از تکنیک

(DGGE) Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

اشاره کرد. ولی بررسی تنوع باکتريها براساس کارکرد و

۲/۲ Nova Biologica Reperta 1 (2): 1-9 (2015)

متابولیسم آنها با استفاده از community level

(CLPP) physiological profiles روش جدیدي است که بوسیله میکروپلیتهاي BiologTM Ecoplate اندازهگیري میشود. میکروپلیتهاي اکوپلیت (Ecoplate) شامل منابع مختلف کربنی و دیگر مواد مغذي است (شکل (۱؛ که باکتري-ها با مصرف این منابع براي تولید انرژي، رنگ خانهها را با احیاي تترازولیوم به رنگ صورتی تغییر میدهند که با خواندن شدت و تنوع مواد کربنی مورد استفاده با توجه به محتوي باکتريها با روش کالریمتري، تنوع متابولیکی باکتريهاي هترتروف هوازي و بیهوازي بهدست میآید. این میکروپلیتها براي اولینبار در بخش پزشکی براي شناسایی سویههاي مختلف میکروارگانیسمها بهکار رفتند که در مراحل بعدي براي بررسی تنوع کارکردي باکتريها در دیگر اکوسیستمها ازجمله

درخاك (Preston-Mafham et al., 2002; Weber &

Legge, 2009) و فلور باکتريهاي هوازي روده تاسماهی سیبري بهکارگرفته شد .(Najdegerami et al., 2011)

پلیبتاهیدروکسی بوتیرات (PHB) یکی از ترکیبات کربنی خانواده پلیبتاهیدروکسی آلکانات هست که بهمنزله ذخیرة منبع کربنی در سلول بهکار میرود (Kato et al., 1992; Patnik, .2005) این ماده در موقعیتی که میزان منابع کربنی محیط زیاد و برعکس میزان نیتروژن محیط کم است، در طیف وسیعی از باکتريها بهعنوان منبع ذخیرة کربنی تشکیل میشود

(Defroidt et al., 2007; Halet et al., 2007; Van Cam .et al., 2009) براساس مطالعات صورتگرفته این ماده در اثر
فعالیت آنزیمهاي گوارشی موجود و همچنین تخمیر میکروبی انتهاي روده به بتابوتیریک اسید تبدیل میشود که کارکردي مشابه اسیدهاي چرب کوتاهزنجیره دارد که با اسیديکردن روده و همچنین استفاده از آن بهعنوان یک مادة انرژي باعث بهبود وضعیت جاندار میشود. اثرات مثبت این ماده در افزایش مقاومت آرتمیا فرانسیسکانا دربرابر Vibriosis، (Defroidt et

al., 2007; Halet et al., 2007; Van Cam et al.,

۲۰۰۹) ، افزایش رشد و تنوع باکتریایی در بچهماهیان سیباس اروپایی((De Schryver et al., 2009 و تاسماهی سیبري (Najdegerami et al., 2011) و افزایش رشد و کاهش میزان

یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد ۱، شمارة ۱- ۹ :۲

گونههاي ویبریو در روده میگوي دراز آب شیرین در مطالعات مختلف گزارش شده است .(Nhan et al., 2010)

در این مطالعه تأثیر پلیبتاهیدروکسی بوتیرات بر تنوع متابولیکی باکتريهاي بی هوازي روده بچهماهیان تاسماهی سیبري با استفاده از روش CLPP بررسی شد.

مواد و روشها

این آزمایش به مدت ۱۰ هفته در حوضچههاي فایبرگلاس با رنگ تیره ۷۵) لیتري) که هر ۱ ساعت ۱۰۰ درصد آب آن تعویض می شد انجام گرفت. درجه حرارت آب در طول آزمایش ثابت و حدود ۱۵ ± ۱ درجه سانتیگراد بود. دورة نوري ۱۲ ساعت روشنایی و ۱۲ ساعت تاریکی براي بچهماهیان اعمال شد. بچهماهیان با وزن اولیه ۱۷ ± ۰/۸ گرم و با تراکم ۸ گرم در لیتر در این حوضچهها ذخیره سازي شدند و به مدت دوهفته با جیرة غذایی تجاري (Joosen – Luyckx, Aqua Bio, Belgium) تغذیه شدند. میزان غذاي مصرفی در ۳ وعده ۸:۰۰)، ۱۳:۰۰ و (۱۸:۰۰ با توجه به میزان تغذیه روزانه بچهماهیان وزن و غذادهی میشد و غذاي اضافه در هر وعدة غذایی سیفون و از میزان غذاي محاسبهشده کسر میشد (Najdegerami et

.al., 2011)

بعد از ۲ هفته تغذیه با غذاي تجاري، از ۳ جیرة تحقیقاتی شامل صفر درصد PHB (کنترل)، ۲ درصد PHB و ۵ درصد PHB استفاده شد. براي تهیه این جیرهها ابتدا میزان مورد استفاده PHB محاسبه و در کلروفرم و آب با نسبت ۸۰ به ۲۰ حل شد و سپس روي جیرة تجاري اسپري شد. جیرهها در درجه حرارت اتاق براي ۲ روز نگهداري شدند تا تمام کلروفرم تبخیر شود و سپس در دماي ۴ درجه سانتیگراد نگهداري شدند. براي اطمینان از خشکشدن آنها، جیرهها ۳ روز قبل از شروع آزمایش تهیه شدند .(Najdegerami et al., 2011) براي اندازهگیري میزان CLPP براي باکتريهاي بیهوازي انتهاي روده، از میکروپلیتهاي (Biolog Biolog TM Ecoplate Inc.) استفاده شد که شامل ۳۱ منبع کربنی بهعلاوة یک کنترل منفی (آب) در ۳ تکرار بود .(Insam, 1997) براي اینکار ۳ ماهی از هر تکرار با استفاده از محلول ۲ میلیلیتر ۲-

۳/۳ Nova Biologica Reperta 1 (2): 1-9 (2015)

Phenoxyethanol در یک لیتر آب بیهوش شدند و پساز بازکردن قسمت شکمی در وضعیت استریل، محتویات انتهاي رودة آنها برداشت و پساز مخلوطکردن، ۱ گرم (وزن تر) آن در ۱۰ میلیلیتر سرم فیزیولوژي %۰/۸۵) نمک) حل و با همزن خوب مخلوط شد .(Najdegerami et al., 2011) سپس براي صافکردن این سوسپانسیون و جداکردن ذرات غیر قابل حل از فیلتر ۵۰ میکرون استفاده شد و محلول بدست آمده ۱۰ بار رقیق شد و حجم محلول به ۱۰۰ میلیلیتر رسید. به هر کدام از خانه هاي اکوپلیتها، ۱۳۰ میکرولیتر از این محلول ریخته شد و میکروپلیتها در حرارت ۲۵ درجه سانتیگراد در شرایط بی هوازي (oxoid anaerobic jar, HP001A) به مدت ۹۶ ساعت نگهداري شدند و میزان جذب نور هرکدام از خانهها، با استفاده از دستگاه پلیت ریدر ( TECAN, Model infinite (M200 در ساعتهاي ۲۴، ۴۸، ۷۲ و ۹۶ در طول موج ۵۹۰ خوانده شد و میانگین تکامل رنگ در خانههاي میکروپلیت با فرمول AWCD=Ʃ(C-R)/n محاسبه شد. در این فرمول C میزان جذب نور در داخل هرکدام از خانههاي میکروپلیت پس از انکوباسیون، R میزان جذب نور در خانه حاوي آب و n تعداد سوبسترا در میکروپلیتها است که در میکروپلیتهاي Ecoplate این تعداد ۳۱ است. هر کدام از دادههاي خام حاصل از دستگاه پلیت ریدر بهوسیله میانگین تکامل رنگ خانههاي میکروپلیت (AWCD) نرمال شدند (Garland & Mills, .1991) شاخص شانون ایندکس (H΄) که یک شاخص تنوع براي اکوسیستمها بهشمار میرود براي باکتريهاي بی هوازي روده بچهماهیان تاسماهی سیبري که از درصدهاي مختلف PHB تغذیه کرده بودند با توجه به رابطه زیر محاسبه شد:

که در این رابطه Pi جذب نسبی در هر خانه میکروپلیت است. همچنین براي بررسی evenness در این باکتريها از رابطه E = H΄/ ln S استفاده شد که در این رابطه H΄ شانون ایندکس است

و S تعداد خانههایی است که باکتريها در آن متابولیسم داشتند

و باعث تغییر رنگ خانه شدند. گفتنی است که در تمام محاسبات، خانههایی از میکروپلیتها که تغییر رنگ نداشتند در

یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد ۱، شمارة ۱- ۹ :۲

محاسبات بعدي صفر در نظر گرفته شدند. همچنین در این آزمایش منحنی Pareto-Lorenzکه عمدتاً براي بررسی تنوع زیستی در اکوسیستمها و همچنین پراکنش نسبی گونهها بهکار میرود براي بررسی این پارامترها در باکتريهاي بیهوازي در رودة بچهماهیانی که از تیمارهاي غذایی تغذیه کرده بودند مورد استفاده قرار گرفت.

محاسبات آماري

تمام آزمونهاي آماري در نرمافزار آماري SPSS نسخه ۱۶ انجام گرفت. دادهها در مرحله اول از بابت همسانبودن واریانسها تحت بررسی قرار گرفتند و بعد از اطمینان از همسانی واریانسها، تحلیل واریانس یکطرفه در سطح معنیدار ۹۵ درصد براي شاخصهاي shannon diversity و evenness

اجرا شد. براي تعیین معنیدار بودن بین میانگینها از آزمون دانکن استفاده شد.
نتایج

میانگین تکامل رنگ در خانههاي میکروپلیت (AWCD) براي ارزیابی میزان فعالیت متابولیکی باکتريهاي بیهوازي قابل کشت مورد استفاده قرار گرفت. چنانکه در شکل ۱ دیده می-شود تغذیه بچهماهیان با PHB میزان فعالیت متابولیکی باکتري-هاي قابلکشت بیهوازي را نسبت به تیمار کنترل افزایش داده است. این میزان افزایش در تیمارهاي ۲ و ۵ درصد PHB به ترتیب ۱۴ و ۲۲/۵ درصد بوده است.

میزان فعالیت باکتريهاي بیهوازي در هرگروه از منابع کربنی محاسبه شد و نتایج آن در شکل ۲ آمده است. چنانکه در شکل ۲a که فعالیت باکتريهاي بیهوازي را در منابع کربنی پلیمري

۴/۴ Nova Biologica Reperta 1 (2): 1-9 (2015)

نشان میدهد مشاهده میشود، میزان متابولیسم یا فعالیت متابولیکی باکتريها در تیمار ۵ درصد PHB بالاتر از کنترل و ۲ درصد PHB است، درحالیکه میزان فعالیت متابولیکی باکتري-ها در منابع کربنی دیگر مانند کربوکسیلیک اسیدها (شکل (۲d و اسیدهاي آمینه (شکل (۲b در تیمار ۲ درصد PHB بالاتر از دیگر تیمارها بود. این افزایش فعالیت متابولیکی در باکتريها دربارة مصرف اسیدهاي آمینه در تیمار ۲ درصد بهترتیب ۲۷ و ۴۸ درصد بالاتر از تیمار کنترل و ۵ درصد بود. همچنین افزایش میزان متابولیسم باکتريها در مصرف منبع کربنی کربوکسیلیک اسیدها در تیمار ۲ درصد بهترتیب ۱۴۲ و ۳۱ درصد بیشتر از تیمار کنترل و ۵ درصد بود.