مقدمه

با وجودي که فاکتورهاي خطر متعددي در بروز سرطان .(۲۲) وجود سابقه یا پیشینه سرطان پستان در اقوام درجه
پستان شناسایی و معرفی گشته اند، اما هنوز علت دقیق و یک می تواند یکی از فاکتورهاي خطر مهم در ابتلاء به
قطعی سرطان مذکور به صورت ابهام باقی مانده است سرطان پستان باشد. حدود ۱۵ درصد از موارد ابتلاء به
۳۶۵

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

سرطان پستان پیشینه خانوادگی مثبت داشته و مطالعات نشان داده اند که درصدي از آنها می تواند مربوط به توارث ژنهاي مستعد کننده سرطان باشد ۱۳)، ۲۵ و .(۲۶
متاستاز مرحله خطرناك سرطان است به طوري که مرحله متاستازي سرطان پستان تقریبًا غیر قابل درمان می باشد

.(۲۷)

امروزه سلولهاي بنیادي سرطانی ( Cancer stem (cell=CSC به عنوان منشاء متاستاز و عامل عود و برگشت

سرطان مطرح هستند Csc .(2) ها سلولهاي توموري

می باشند که توانایی خودنوسازي و تولید دودمانهاي

ناهمگونی از سلولهاي سرطانی مولد تومور را دارا
می باشند Csc .(19) ها از بسیاري از سرطانها نظیر

سرطانهاي پستان، مغز، پروستات، شش، پانکراس و کولون جداسازي و شناسایی شده اند ۲۰) و .(۲۱ تومورزایی و گسترش متاستازي Csc ها به توانایی بالاي آنها در تولید سیتوکین ها و پروتئازهایی نظیر ماتریکس متالوپروتئینازها بر می گردد ۲)، ۱۹، ۲۰ و .(۲۱ این آنزیمها خانواده اي از پروتئینهاي ترشحی یا غشایی می باشند که قادرند تقریباً کلیه ترکیبات غشاي پایه و ماتریکس خارج سلولی
(ECM) را که دو سد فیزیکی مهم در برابر مهاجرت و گسترش سلولهاي توموري هستند را تجزیه و تخریب نمایند ۱)، ۸ و .(۴۱ در واقع Csc ها با ترشح آنزیمهاي مذکور، ماتریکس خارج سلولی را شکسته و سبب رهایش فاکتورهاي رشد و رگزایی باند شده به ECM می گردند؛ بدین ترتیب می توانند به جریان خون در رگها نفوذ نمایند و سپس در ارگان دیگر از جریان خون خارج شوند و در ارگان جدید ساکن و ایجاد سرطان ثانویه کنند ۱۰)، ۲۹

و.(۴۰

کلاژناز فیبروبلاستی یا ماتریکس متالوپروتئیناز-۱ قادر است کلاژنهاي فیبري که فراوان ترین پروتئین تشکیل دهنده بدن می باشد را هضم نماید. ناحیه پروموتوري کلاژناز فیبروبلاستی واجد عناصر تنظیمی حفاظت شده اي

است که توسط فاکتورهاي رشد، سیتوکینها و فاکتورهاي محیطی کنترل می گردد ۳۵) و .(۳۶ در شرایط نرمال بیان ژن کلاژناز فیبروبلاستی در بافتها پایین است و تنها زمانی که باز آرایش ECM نیاز باشد افزایش می یابد ۶)، ۳۸و .(۳۹ در مقابل در بسیاري از انواع تومورها سطح بالایی از کلاژناز فیبروبلاستی بیان می گردد ۳)، ۵ و . (۱۲ مطالعات اخیر افزایش بیان کلاژناز فیبروبلاستی را در بافتهاي توموري مختلفی نشان داده اند و پیشنهاد کرده اند پروتئین مذکور می تواند در تهاجم توموري و متاستاز دخیل باشد

۷)، ۱۱، ۲۸، ۳۱، ۳۴ و.(۴۳

بیان ژن کلاژناز فیبروبلاستی تحت تأثیر یک پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدي (SNP) در ناحیه پروموتوري آن قرار می گیرد. این پلی مورفیسم به طور طبیعی در جمعیتها وجود دارد و شامل دخول/حذف یک باز گوانین در موقعیت

-۱۶۰۷ جفت بازي پروموتور ژن کلاژناز فیبروبلاستی است. مطابق با شکل ۱ دخول گوانین یک توالی همسان براي فاکتورهاي رونویسی (۵ GGAT۳) ETS

ایجاد می کند .(۳۰) جایگاه ایجاد شده در اثر دخول گوانین (آلل (۲G در مجاورت جایگاه اتصال AP-1 در موقعیت -۱۶۰۲ قرار دارد. با توجه به اینکه اعضاي خانواده ETS براي القاي رونویسی احتیاج به فاکتورهاي رونویسی دیگري همچون اعضاي خانواده AP-1 دارند، دو جایگاه مجاور مذکور، به صورت سینرژیک عمل می کنند و با همکاري یکدیگر رونویسی را از آلل واجد ۲G افزایش میدهند ۳۷) و .۴۲ شکل .(۱

با توجه به مطالب ارائه شده ژنوتیپ ۲G/2G می تواند پتانسیل بیان ژن کلاژناز فیبروبلاستی را افزایش دهد وگسترش متاستاز و عود و برگشت بیماري را در افراد مبتلا به سرطان پستان تسهیل نماید. لذا در مطالعه حاضر تأثیر ژنوتیپ مذکور بر تهاجم و متاستاز افراد مبتلا به سرطان پستان ارزیابی و ارتباط آن با میزان بقاي کلی ۳

۳۶۶

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

ساله، بقاي ویژه سرطان و بقاي عاري از بیماري بررسی گردید.

شکل -۱ در آلل ۲G ژن کلاژناز فیبروبلاستی ، جایگاه اتصال فاکتورهاي رونویسی ETS در مجاورت جایگاه اتصال AP-1 ایجاد می شود.

مواد و روشها

۴ میلی لیتر خون وریدي از ۲۰۰ خانم مبتلا به سرطان پستان و ۱۰۰ نمونه کنترل به نسبت مساوي از بیمارستان امید واقع در شهر اصفهان ۱۰۰) نمونه سرطان پستان و ۵۰

نمونه کنترل) و بیمارستان امام خمینی واقع در شهر تهران

۱۰۰) نمونه سرطان پستان و ۵۰ نمونه کنترل) جمع آوري گردید. بیمارستانهاي مذکور از بیمارستانهاي بزرگ ایران می باشند که افراد مبتلا به سرطان از نواحی دور و نزدیک براي معالجه و درمان به این مراکز مراجعه می کنند. از کلیه افراد بیمار و کنترل شرکت کننده در مطالعه حاضر رضایت نامه کتبی گرفته شد. افراد کنترل به نحوي انتخاب شدند که

از لحاظ سنی با گروه بیمار مطابقت داشته و سابقه و پیشینه سرطان در بستگان درجه یک آنها دیده نشده باشد. افراد بیمار به مدت میانگین ۳۲ ماه ۲۲-۴۶) ماه) تحت بررسی و پیگیري قرار گرفتند و هر گونه تغییر در وضعیت بیماري آنها ثبت و ضبط گردید.

DNA ژنومی کلیه نمونه هاي خون پس از انتقال به دانشگاه اصفهان از روش نمکی میلر با مقداري دستکاري وتغییرات استخراج گردید .(۲۴) در مرحله بعد فرآیند

PCR به منظور تکثیر پلی مورفیسم پروموتور ژن کلاژناز فیبروبلاستی با استفاده از پرایمرهاي زیر انجام گرفت:

Forward: 5 ‘-TGACTTTTAAAACATAGTCTATGTTCA-3′ Reverse: 5’-CTTGGATTGATTTGAGATAAGTCATAgC-3

یک جهش از T به G در دومین نوکلئوتید مجاور انتهاي۳΄

پرایمر معکوس ایجاد گردید تا جایگاه شناسایی براي آنزیم محدود کننده Alu I در آلل ۱G حاصل شود.

تکثیر DNA در حجم ۲۵ µl شامل ۱۰۰ ng از DNA

الگو، ۲/۵ µl از بافر ۱۰X PCR ،۲۰۰ mM از MgCl2 و ۲/۵ u از DNA پلیمراز Taq، ۰/۲ mM از مخلوط dNTP، ۲۰ pM از پرایمرهاي رفت و برگشت با برنامهریزي

دستگاه ترموسایکلر صورت گرفت: دماي دناتوره اولیه در

۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۴ دقیقه که با ۳۰ سیکل به ترتیب با دماي دناتوره ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰

ثانیه، دماي اتصال ۵۸ درجه سانتی گراد براي پرایمرهاي طراحی شده به مدت ۳۰ ثانیه و دماي تکثیر ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه تکرار گردید. در انتها ۱۰

۳۶۷

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

دقیقه ۷۲ درجه سانتی گراد براي تکمیل فرآیند تکثیر انجام گرفت.

سپس ۴-۵ میکروگرم از محصول PCR به مدت ۵-۶

ساعت در دماي ۳۷ درجه سانتی گراد در ۲۰ میکرولیتر محلول واجد ۵ واحد آنزیمی ./۵ ) Alu1 میکرولیتر) و ۲

میکرولیتر بافر ۱۰X Tango TM هضم گردید. پس از هضم آنزیمی، محصولات بر روي ژل آگاروز ۳ درصد رنگ شده با اتیدیوم بروماید جداسازي شدند.

هموزیگوت هاي آلل ۲G با باندي به طول ۲۶۹ جفت باز، هموزیگوت هاي آلل ۱G با باندي به طول ۲۴۱ جفت باز و هتروزیگوت ها با ترکیبی از هر دو باند ۲۶۹) و ۲۴۱

جفت بازي) بر روي ژل ظاهر شدند.

آنالیزهاي آماري:آزمونهاي آماري با استفاده از نرم افزار

SPSS انجام گرفت. در تحقیق حاضر، به منظور بررسی اختلاف میان توزیع ژنوتیپی در گروههاي مختلف بیماران و افراد کنترل از آزمون ۲ ، استفاده گردید. نسبت افزاینده (Odd Ratio) با فاصله اطمینان ۹۵ درصد براي تخمین ارتباط میان پلی مورفیسم پروموتور ژن کلاژناز فیبروبلاستی و ریسک رشد و تهاجم پستان و میزان مرگ و میر این افراد محاسبه گشت. در کلیه محاسبات، سطح احتمال P<0/05، از نظر آماري معنیدار فرض گردید.

آنالیزهاي بقاء: معاینات و آزمایشهاي منظمی هر ۳ ماه یک بار بر روي افراد مبتلا به سرطان پستان انجام گرفت. در طول مدت پیگیري با مراجعه به پرونده هاي پزشکی، آزمایشهاي انجام شده و مصاحبه با پزشک معالج هر گونه تغییر در وضعیت بیماري و یا بقاي بیمار لحاظ گردید.

میزان بقاي کل به عنوان مدت زمان بین جراحی تا مرگ به هر دلیل، میزان بقاي ویژه سرطان مدت زمان بین جراحی تا مرگ در اثر سرطان و میزان بقاي عاري از بیماري به صورت مدت زمان بین جراحی تا عود مجدد و یا متاستاز تعریف گردید. براي بقاي کل تمام مرگها بدون توجه به

دلیل آن منظور گردید و براي بقاي ویژه سرطان تنها مرگهاي ناشی از سرطان محاسبه گردیدند.

منحنیهاي بقاء با استفاده از روش کاپلان – میر رسم و باتست لاگ- رانک مقایسه گردیدند.

نتایج

۲۰۰ نمونه خون از بیماران مبتلا به سرطان پستان و ۱۰۰

نمونه خون از افراد کنترل به طور مساوي از اصفهان و تهران جمع آوري گردید. میانگین سنی افراد بیمار ۵۷/۹ در محدوده ۲۵-۸۶ سال بود و متعاقبًا توزیع سنی همسانی نیز در انتخاب افراد کنترل لحاظ گردید ( ± ۵ سال). کلیه نمونه هاي گرفته شده با موفقیت تعیین ژنوتیپ شدند

(شکل .(۲ جدول ۱ توزیع ژنوتیپی را در افراد کنترل و بیمار دو شهر اصفهان و تهران نشان می دهد. مطابق داده هاي ارائه شده در جدول مذکور تفاوت آماري معنی داري در توزیع ژنوتیپی ژن کلاژناز فیبروبلاستی بین جمعیت کنترل و بیمار دو شهر تهران و اصفهان دیده نمی شود

(براي افراد بیمار: P =0/99، χ²=۰/۰۰۱۸ و براي افراد کنترل P =0/97، .(χ²=۰/۰۶ لذا، در کلیه محاسبات آماري انجام شده، این دو جمعیت به عنوان یک جمعیت واحد در نظر گرفته شدند.

در ادامه مطالعات آماري، تفاوت معنی داري در توزیع ژنوتیپی ژن کلاژناز فیبروبلاستی در بین افراد بیمار و کنترل جمعیت واحد ملاحظه شد. فراوانی ژنوتیپی ۱G/1G،
۲G/1G و ۲G/2G به ترتیب در افراد بیمار برابر %۱۹/۵ ، %۵۱ و %۲۹/۵ و در افراد کنترل برابر با %۲۶، %۵۱ و %۲۳

بود P =0/04)، . ( χ²=۵/۹۹

در مرحله بعدي آنالیزها، بیماران به دو دسته متاستازي

M+)، بیمارانی که گسترش متاستاز در آنها تشخیص داده شد) و بیماران غیر متاستازي M-)، بیمارانی که گسترش متاستاز در آنها دیده نشد) تقسیم گردیدند.

۳۶۸

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

۲۶۹ ۵۰۰
۲۴۱ ۴۰۰

۳۰۰

۲۵۰

شکل – ۲ الکتروفورز مطالعات . PCR-RFLP الکتروفورز بر روي ژل %۳ آگارز و در ولتاژ ۷۰ ولت به مدت دو ساعت و نیم انجام

گرفته است. فرد ۱و ۴ هموزیگوت ۲G، فرد۲ هموزیگوت ۱G و فرد ۳ هتروزیگوت ۱G/2G می باشد DNA :M) مارکر .(۵۰bp

سپس فراوانی ژنوتیپی که سبب تولید بالاترین مقدار آنزیم کلاژناز فیبروبلاستی می گردد (ژنوتیپ (۲G/2G با ژنوتیپهاي داراي حداقل یک آلل ۱G/2G) 1G و ( ۱G/1G

در بین افراد M+ ، M- و کنترل مقایسه گردید. نتایج نشان داد که هیچ اختلاف مهم آماري در توزیع گروههاي ژنوتیپی افراد غیر متاستازي و کنترل وجود ندارد =۰/۷۸)

P، .( χ²=۰/۰۷۸ اما در مقابل، ژنوتیپ هموزیگوت ۲G/2G

در مقایسه با گروه کنترل، ارتباط و پیوستگی قوي با گروه متاستازي نشان داد CI95% =1/05- 3/94) و OR =2/03،

جدول .(۲ به منظور بررسی دقیق نقش ژنوتیپ هموزیگوت ۲G در میزان تهاجم و متاستاز سرطان پستان، افراد غیر متاستازي به مدت ۴۶-۲۲ ماه ( میانگین ۳۲ ماه)

تحت بررسی و پیگیري قرار گرفتند. مطابق آخرین بررسیهاي انجام شده وضعیت بیماران به صورت زیر به دست آمد (جدول :(۳

۷۸ درصد بیماران بدون بروز هیچ نشانه مجددي از بیماري زنده بودند. در ۱۴ درصد بیماران گسترش بیماري گزارش گردید. ۳ درصد بیماران در اثر گسترش سرطان فوت کرده بودند و حدود ۱/۶ درصد بیماران به علت حوادث دیگر غیر از سرطان مذکور جان سپرده بودند.

نتایج حاصل از مطالعات آماري نشان دادند که افراد واجد ژنوتیپهاي ۲G/2G نسبت به افراد واجد ژنوتیپهاي ۱G/2G

و ۱G/1G در معرض خطر فزآینده اي براي متاستاز و تهاجم سرطان پستان روبه رو هستند.

جدول -۱ توزیع ژنوتیپی پلی مورفیسم پروموتور ژن کلاژناز فیبروبلاستی افراد کنترل و بیمار در جمعیت تهران، اصفهان و جمعیت کل.

جمعیت کل اصفهان تهران گروه
۲/۲ ۱/۲ ۱/۱ ۲/۲ ۱/۲ ۱/۱ ۲/۲ ۱/۲ ۱/۱
۲۳(%۲۳) ۵۱(%۵۱) ۲۶(%۲۶) ۱۲(%۲۴) ۲۵(%۵۰) ۱۳(%۲۶) ۱۱(%۲۲) ۲۶(%۵۲) ۱۳(%۲۶) n(%) کنترل
۵۹(%۲۹/۵) ۱۰۲(%۵۱) ۳۹(%۱۹/۵) ۳۰(%۳۰) ۵۲(%۵۲) ۲۰(%۲۰) ۲۹(%۲۹) ۵۰(%۵۰) ۱۹(%۱۹) n(%) بیمار

: n تعداد افراد. – توزیع ژنوتیپی ژن کلاژناز فیبروبلاستی بین جمعیت کنترل و بیمار دو شهر تهران و اصفهان تفاوت آماري معنی داري نشان نداد

(براي افراد بیمار: P =0/97، χ²=۰/۰۶ و براي افراد کنترل P =0/99، .(χ²=۰/۰۰۱۸ لذا، در کلیه محاسبات آماري انجام شده، این دو جمعیت به عنوان یک جمعیت واحد در نظر گرفته شدند. – ژنوتیپ ۱G/2G در دوگروه کنترل و بیمار فراوانی یکسانی نشان می دهد، لذا در کلیه محاسبات آماري، این ژنوتیپ همراه با ژنوتیپ ۱G/1G به عنوان گروه واحد در نظر گرفته شد.

۳۶۹

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۳، ۱۳۹۲

جدول -۲ آنالیز ارتباط و پیوستگی گروههاي ژنوتیپی ژن کلاژناز فیبروبلاستی در افراد متاستازي و غیرمتاستازي

OR (95% CI) a ژنوتیپهاي کلاژناز فیبروبلاستی
گروه ها
۲/۲ ۱/۱+۱/۲
– ۲۳(%۲۳) ۷۷(%۷۷) کنترل
۱/۰۹(۰/۵۸-۲/۰۲) b 31(%25) 95(%75) (M-)غیرمتاستازي
۲/۰۳(۱/۰۵-۳/۹۴) c 28(%38) 46(%62) (M+) متاستازي

OR : a محاسبه شده براي ژنوتیپ ۲G/2G در برابر ژنوتیپهاي ۱G/1G + 1G/2G در مقایسه گروههاي غیر متاستازي و متاستازي با گروه کنترل.
:b ژنوتیپ ۲G/2G ارتباط و پیوستگی معنی داري با گروه غیر متاستازي در مقایسه با گروه کنترل نشان نمی دهد. :c ارتباط و پیوستگی معنی داري بین ژنوتیپ ۲G/2G با گروه متاستازي در مقایسه با گروه کنترل دیده می شود.
جدول -۳ بررسی ارتباط پلی مورفیسم پروموتور ژن کلاژناز فیبروبلاستی و میزان بقاي بیماران.

P (Log-rank test) موارد ابتلاء n ژنوتیپ آنالیزهاي بقاء
میزان بقاي کلی
۳ ۹۵ ۱/۱ + ۱/۲
۰/۱۲ ۳ ۳۱ ۲/۲
میزان بقاي ویژه سرطان
۱ ۹۵ ۱/۱ +۱/۲
۰/۰۱ ۳ ۳۱ ۲/۲ a
میزان بقاي عاري از بیماري
۹ ۹۵ ۱/۱ +۱/۲
۰/۰۰۲ a 8 31 2/2
: n تعداد کل افراد. : افراد واجد ژنوتیپ ۲G/2G نسبت به افراد واجد ژنوتیپهاي دیگر در معرض خطر فزاینده متاستاز